高效液相色谱法同时检测液体食品中6种人工合成色素

摘要 [目的]通过优化高效液相色谱条件和前处理步骤，建立高效液相色谱法同时测定液体食品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、诱惑红6种人工合成色素，以此提高合成色素的检测效率。[方法]试验优化了前处理方法，液体食品基质比较干净时采用直接水提进样法，基质比较复杂时采用固相萃取净化法;优化了梯度洗脱程序和波长程序等仪器条件。[结果]6种人工合成色素浓度在5～50 μg/mL 线性关系良好（R2>0.999）;柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、诱惑红的检出限为0.031 25 mg/kg，亮蓝的检出限为0.125 00 mg/kg，样品添加标准物质后平均回收率在89.0%～100.3%，相对标准偏差（RSD）在1.56%～3.12%。[结论]该研究可为实验室日常的人工合成色素检测提供参考。

关键词 高效液相色谱;食品;人工合成色素;仪器条件;前处理;方法优化

中图分类号 TS 207文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）04-0190-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Detection of Six Synthetic Pigments in Liquid Food by High Performance Liquid Chromatography

TONG You-yun1，WANG Xiao-bao2，WANG Xiao-yan1 et al

（1.Sion Inspection Service Co.， Ltd.， Ningbo， Zhejiang 315000;2.Ningbo Academy of Product and Food Quality Inspection （Ningbo Fibre Inspection Institute），Ningbo，Zhejiang 315000）

Abstract [Objective] By optimizing the conditions and pretreatment steps of high performance liquid chromatography， a high performance liquid chromatography method was established for the simultaneous determination of 6 synthetic pigments of lemon yellow， amaranth， carmine， sunset yellow， brilliant blue， and allure red in liquid food， so as to improve the detection efficiency of synthetic pigments.[Method] The experiment optimized the pretreatment method. The direct water extraction method was used when the liquid food matrix was relatively clean， and the solid phase extraction purification method was used when the matrix was more complicated;the instrument conditions such as gradient elution procedure and wavelength procedure were optimized.[Result] The concentration of 6 kinds of synthetic pigments has a good linear relationship between 5-50 μg/mL （R2>0.999）.The detection limit of lemon yellow， amaranth， sunset yellow， carmine and allure red was 0.031 25 mg/kg， and the detection limit of brilliant blue was 0.125 00 mg/kg. The average recovery rate of samples after adding standard substances was 89.0%-100.3%，the relative standard deviation （RSD） was 1.56%-3.12%.[Conclusion] This study can provide reference for the daily synthetic pigment detection in laboratories.

Key words High performance liquid chromatography （HPLC）;Food;Synthetic pigments;Instrument conditions;Pretreatment;Method optimization

作者简介 童优芸（1987—），女，浙江宁波人，工程师，从事食品质量检测工作。

收稿日期 2021-06-22;修回日期 2021-07-15

食用人工合成色素是通过人为化学合成的一类有机物质，由于其本身艳丽的色彩，可作为食品加工过程中的着色剂，不仅使食品具有赏心悦目的色彩，更能增加商品的价值，吸引消费者的眼光。但是，人工合成色素其本身或者次生的产物对人体产生一定的毒性，另外一些不法商贩超标、超范围使用人工合成色素的现象屡禁不止，长期过多地摄入人工合成色素会使人们的健康受到威胁[1-3] 。所以，加强食品安全的监管，提高检测技术，开发一种快速、便捷、准确的检测方法势在必行。目前，检测人工合成色素的国家标准方法主要有GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》、GB/T 5009.141—2016《食品中诱惑红的测定》、GB/T 9695.6—2008《肉制品 胭脂红着色剂测定》、GB/T 21916—2008《水果罐头中合成着色剂的测定 高效液相色谱法》、SNT 1743—2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测 高效液相色谱法》，所用分析手段有高效液相色谱法[4-6]、电泳法[7-8]、分光光度法[9]等，主要以高效液相色谱法为主，以上方法对食品中人工合成色素测定应用或参考具有一定的价值，但同时存在一些问题，如部分标准适合单个合成色素或单种食品基质测定;采用聚酰胺吸附法过程烦琐、耗时;色谱条件不合理导致目标峰分离度差;纸层析色谱法回收率低、检出限高、精密度差等[10]。该试验拟在国家标准的基础上，开发一种更为简单有效的样品前处理方法，并建立一种能同时检测多种人工合成色素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品为市售液体食品。日落黄标准溶液、柠檬黄标准溶液、胭脂红标准溶液、苋菜红标准溶液、亮蓝标准溶液、诱惑红标准溶液，浓度均为0.500 mg/mL，中国计量科学研究院;甲醇，色谱纯，默克;甲酸，色谱纯，美国MREDA;乙醇、氨水、乙酸铵，优级纯，国药集团化学试剂有限公司;试验用水均为超纯水（一级）。聚酰胺小柱，1 g/6 mL，博纳艾杰尔有限公司;HLB萃取柱，6cc（200 mg），Waters公司;色谱柱，XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国安捷伦公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，Agilent 1200，美国安捷伦公司;超声波，SK8200HP，KUDOS;纯水机，UPWS-1-10T，杭州永洁达净化科技有限公司;离心机，Fisher x1r，Thermo;固相萃取装置，ASE-12，天津奥特赛恩斯仪器有限公司;氮吹仪，N-EVAP112，OA-SYS;电子天平，BS 224S，Sartorius;紫外分光光度计，Lambda 25，PrekinElmer。

1.3 仪器工作条件

色谱柱为美国安捷伦XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;进样量20 μL;柱温30 ℃;流速1 mL/min;流动相为甲醇-乙酸铵0.02 mol/L[11];流动相pH 6～7。波长程序：0～9.5 min，检测波长254 nm;9.5～16.0 min，检测波长409 nm。流动相梯度洗脱程序见表1。

1.4 试验方法

1.4.1

基质干净的液体样品前处理法。称取20～40 g（精确至0.001 g）样品，调pH至6左右，定容至10 mL，用超声波振荡10 min，5 000 r/min离心10 min，过0.45 μm 水相滤膜，收集至样品瓶，上机。

1.4.2

基质复杂的液体样品前处理法。

1.4.2.1 提取。①饮料：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入100 mL烧杯中，含二氧化碳样品加热去除二氧化碳，调pH至6左右备用。

②酒类：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入100 mL烧杯中，加热去除乙醇，调pH至6左右备用[12]。

③酱汁类：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入50 mL离心管中，加入20 mL 石油醚，漩涡混匀1 min，5 000 r/min离心5 min，弃去石油醚上清液，加入10 mL 1%氨水溶液，漩涡1 min，4 000 r/min 离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，调pH至6左右备用。

1.4.2.2

净化。先用6 mL甲醇、6 mL水（pH=6～7）活化聚酰胺小柱（1 g/6 mL），加入样液，用6 mL水（pH=4）、6 mL甲醇∶甲酸（6∶4）、6 mL水（pH=6～7）淋洗，通入空气吹干小柱，用6 mL 2%的氨化甲醇洗脱，洗脱液于50 ℃氮气吹干，用水定容至5 mL，过0.45 μm水相滤膜，收集至样品瓶，上机。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择。用紫外分光光度计对柠檬黄、日落黄、亮蓝、胭脂红、苋菜红、诱惑红进行200～600 nm波长扫描，通过分析物质的特征波长，得到各物质的最大吸收波长分别为柠檬黄260 nm、日落黄230 nm、苋菜红230 nm、胭脂红220 nm、亮蓝410 nm、诱惑红220 nm。除亮蓝外的5种人工合成色素在250 nm下均有较好的紫外吸收，且出峰时间比亮蓝早，所以在0～9.5 min紫外吸收波长设置为254 nm，而亮蓝在410 nm下有较好的紫外吸收，其出峰时间在10 min左右，所以9.5 min后紫外吸收波长设置为409 nm。6种人工合成色素可在波长程序下有较好的响应值。

2.1.2

梯度洗脱程序的选择。GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》中采用的洗脱条件，得到的色谱图中各个目标峰基本能分开，且峰形良好。但是柠檬黄和苋菜红这2个物质出峰时间比较接近，容易被杂质峰覆盖，进而影响定性和定量。该试验依据国标洗脱条件，并参考其他相关文献，对甲醇和乙酸铵2个流动相的比例进行调整，发现适当拓宽甲醇的比例范围能使各个目标峰具有更好的分离度，而且能使柠檬黄和苋菜红的出峰时间延长，有效地与杂质峰进行分离。优化条件后图谱和国标方法比较见图1。

2.1.3 色谱柱的选择。色谱柱是分离的核心，选择色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3、5、7、10 μm等。C18和C8色谱柱的应用较为广泛，都属于反相色谱柱。C8适合分析大分子类的物质，其对同一个物质的保留能力比C18柱弱，保留时间比C18柱早，一些物质出峰过于靠前时使用C8柱很难实现分离。C18柱对中等极性化合物保留最强，主要应用于羧基、脂肪酸、苯胺、甘油酯等物质的测定，对分子量较小的物质有较好的分离效果。因此，考虑合成色素的保留时间和分离度，选用C18柱作为此次试验的色谱分析柱。

2.1.4

流动相pH的选择。在其他条件固定的情况下（因为考虑到出峰时间的不一致，所以未采用波长程序），试验用柠檬酸和氨水调节乙酸铵的pH，分别比较了pH为4、6、8时的图谱情况。结果表明（图2），当pH为4和8时，均出现基线漂移、定量不准的现象;当pH为6时，色谱图出峰良好，且呈现较好的分离度。因此，选择流动相pH为6。