体外筛选中药胆碱酯酶抑制剂

摘要 [目的]从中药中发现新颖的胆碱酯酶抑制剂（ChEI）。[方法]采用4种溶媒从14种中药中提取了56种粗提物，并对14种中药的56种中药提取物进行乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）抑制活性筛选。[结果] 虎杖乙酸乙酯提取物和云木香石油醚提取物表现出AChE和BuChE双重抑制作用，这2种提取物为阿尔兹海默氏症的治疗提供了巨大的潜力。大多数中药乙酸乙酯提取物均显示出较强的BuChE抑制活性。提取物抑制AChE和BuChE的IC50分别为16.00～42.03和11.29～41.92 μg/mL。[结论]中药可以作为胆碱酯酶抑制剂的潜在来源。

关键词 胆碱酯酶抑制;阿尔茨海默氏症;中药;体外筛选

中图分类号 R 96  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）06-0149-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of Traditional Chinese Medicine Cholinesterase Inhibitors  in vitro

ZHENG Yan1，MIAO Yu-jing1，2，JIANG Yuan1，3 et al （1.Key Laboratory of Chinese Medicine Resources Conservation，State Administration of Traditional Chinese Medicine of China，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193;2.Engineering Research Center of Chinese Medicine Resource，Ministry of Education，Beijing 100193;3.Dali University，Dali，Yunnan 671000）

Abstract [Objective] To discover a novel cholinesterase inhibitor （ChEI） from traditional Chinese medicine.[Method]56 kinds of crude extracts were extracted from 14 kinds of traditional Chinese medicines using 4 kinds of solvents，and 56 kinds of traditional Chinese medicine extracts from 14 kinds of traditional Chinese medicines were screened for acetylcholinesterase （AChE） and butyrylcholinesterase （BuChE） inhibitory activities.[Result] The ethyl acetate extract of  Polygonum cuspidatum  and the petroleum ether extract of  Carmelia serrata  exhibited dual inhibitory effects on AChE and BuChE，and these two extracts provided great potential for the treatment of Alzheimer′s disease.Most of the traditional Chinese medicine ethyl acetate extracts showed strong BuChE inhibitory activity.The IC50 of the extracts against AChE and BuChE were 16.00-42.03 and 11.29-41.92 μg/mL，respectively.[Conclusion]Traditional Chinese medicine can be a potential source of cholinesterase inhibitors.

Key words Cholinesterase inhibition;Alzheimer’s disease;Traditional Chinese medicine; In vitro  screening

基金项目 北京市自然科学基金项目（7202135）。

作者简介 郑燕（1997—），女，四川成都人，硕士研究生，研究方向：中药资源。*通信作者，研究员，博士生导师，从事中药资源与鉴定研究。

收稿日期 2021-06-17;修回日期 2021-07-17

阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s disease）是一种起病隐匿，以进行性认知功能障碍及行为改变为特征的神经系统退行性疾病，现已成为全球性的健康问题[1-4]。研究表明，阿尔茨海默氏症初期的主要病理变化是中枢胆碱系统功能的显著降低[5-8]。胆碱酯酶抑制剂（ChEI）是第一批已被批准用于治疗轻度至中度阿尔茨海默氏症的药物，是通过增强突触中乙酰胆碱浓度来改善认知并调节阿尔茨海默氏症的神经病理学标志物[6，9-11]。

一些基于天然产物的药物，例如利凡斯的明和加兰他敏等，被用于治疗由阿尔茨海默氏症引起的记忆力减退和认知功能障碍。然而，由于它们的不良副作用，例如生物利用度问题和胃肠道紊乱等，这些批准的药物在利用上受到了限制[5，12-13]。人参、五味子、远志和麦冬等中药材也被用于阿尔茨海默氏症病人的认知改善[14-19]。近年来，科学家从植物中分离出许多可以显著提高细胞外乙酰胆碱水平的ChEI化合物，例如延胡索中的普罗托品，吴茱萸中的脱氢吴茱萸碱和石杉中的石杉碱甲乙等[6，7，19]。因此，从中药中提取的ChEI被认为是阿尔茨海默氏症治疗的有潜力的候选药物。此外，乙酰胆碱酯酶/丁酰胆碱酯酶（AChE/BuChE）双重抑制剂具有良好的开发和市场前景。该研究对14种中药的56种中药提取物进行了AChE和BuChE抑制活性筛选，以期为其进一步跟踪分离获得活性先导化合物奠定基础，也为临床治疗阿尔兹海默氏症提供新的用药依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。PURELAB Classic-UVF纯水机（英国ELGA公司）;POLARstargalaxy 微板光学测定仪（德国BMG公司）;Personal Pipettor PP-550MS移液器（美国Apricot Designs公司）;MassL-ynxV 4.1工作站。

1.1.2 试剂。碘化硫代乙酰胆碱（ATCI）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）、氯化丁酰胆碱（BuCh）、氯化丁酰巯基胆碱（BuSCh）、多奈哌齐（Donepezil）、四异丙基甲基焦磷酰胺（ iso -oMPA）、5，5’-二硫双硝基苯甲酸（DTNB），密苏里州圣路易斯;甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）;超纯水。缓冲液和其他试剂均为市售国产分析纯。

1.1.3 试材。14种中药材均由中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所黄林芳教授从四川省和云南省收集所得，再由林余霖教授鉴定。凭证标本存放在中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所标本馆。

1.2 试验方法

1.2.1 待测样品的制备。将14种中药材粉碎成粗粉，取粗粉500 g，先用石油醚浸泡24 h后渗滤提取至提取液颜色浅（或5倍药材量），回收石油醚，得石油醚提取物;残渣挥去石油醚，用80%乙醇湿润后再用3倍量80%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙酸乙酯（EtOAc）萃取2次，合并EtOAc萃取液（上层），浓缩至干，得EtOAc萃取物;母液浓缩至干（下层），得乙醇提取物;残渣挥干乙醇，用3倍量水煮提2次，合并水提取液，浓缩至干，得水提取物，提取流程见图1。

1.2.2 抗乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性的生物测定。

1.2.2.1 酶反应液、底物浓度及DTNB试液浓度的确定。人血浆可直接作为酶源。该试验以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液稀释人血浆80 倍的稀释液作为酶反应液;筛选体系中选用3 mmol/L作为底物的终浓度，以保证较快的反应速度，进而实现高通量。确定DTNB试液的浓度为0.625 mmol/L，终浓度为0.250 mmol/L。

1.2.2.2 AChE和BuChE活性测定方法。

（1）试剂配制。使用Ellman等[20]的方法评估了AChE和BuChE的抑制作用。AChE水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，BuChE水解丁酰胆碱生成胆碱和丁酸。胆碱可以与巯基显色剂DTNB反应生成TNB黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可以反映胆碱酯酶的活力[21-22]。

ATCI、BuSCh和DTNB均以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液临用现配。在384孔板中进行化合物的大规模筛选，用移液枪转移液体，使每孔中含有天然提取物 （终浓度50 μg/mL）5 μL、酶反应液20 μL、BuSCh 20 μL、DTNB 20 μL，反应总体积为55 μL。标准孔以0.05 mol/μL磷酸盐缓冲液来代替样品;以0.05 mol/L磷酸盐缓冲液代替样品及底物作为空白对照;以BuChE的特异性抑制剂 iso -OMPA、AChE的特异性抑制剂Donepezil作为阳性对照，以检验方法的可靠性。

（2）样品筛选。将10 μL AChE/BuChE与5 μL中药提取液（50 μg/mL）混合，然后添加20 μL酶反应溶液。在存在5 μL Donepezil或 iso -PMPA溶液的阳性对照组，重复上述操作，可以评估待测物质在测定中的干扰。通过添加0.625 mmol/L DTNB（20 μL）和ATCI/BuSCh（20 μL）开始反应，将该溶液置于37 ℃下静置60 min。反应完成后，送入微板光学测定仪，在412 nm处测量吸光度，并计算抑制率：抑制率=（ A标准-A样品）/（A标准-A 空白） ×100%，试验重复3次。

使用贝克曼库尔特检测平台进行数据分析，样品筛选试验至少重复2次。对具有显著抑制作用的中药提取物进行剂量依赖性抑制分析。

2 结果与分析

评估了14种中药的4种溶媒（石油醚、乙酸乙酯、乙醇和水）提取物对BuChE和AChE的抑制活性，具体结果见图2和表1。从表1可以看出，除竹节参 （Panax japonicus）和宿柱梣（Fraxinus stylosa） 的乙酸乙酯提取物，其余中药提取物均显示出不同程度的BuChE和AChE抑制活性。粗茎鳞毛蕨 （Dryopteris crassirhizoma）、云木香（Saussurea costus）、鸡屎藤（Paederia scandens）、虎杖（Reynoutria japonica）和越南槐（Sophora tonkinensis） 这5种中药的提取物对BuChE和AChE的抑制作用非常好，表明这5种中药是有前途的治愈阿尔茨海默氏症的自然资源。