苦参生品及其炮制品的2种不同提取方法的抗菌药效研究

摘要 采用水煎煮法和乙醇回流提取法对苦参及其炮制品进行提取，采用牛津杯法测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外最小抑菌浓度（MIC），研究不同提取方法、炮制方法对苦参的抗菌效果。结果表明，醇提液中生品提取液和醋炙品提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，而对大肠杆菌的抑菌效果最好的是生品提取液，MIC值均为0.012 5 g/mL;水提液中炒焦品提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果较好，MIC值分别为0.1和0.2 g/mL。其中醇提液抑菌效果较水提液抑菌效果好;醇提液对大肠杆菌的抑制效果好于金黄色葡萄球菌;水提液对金黄色葡萄球菌的抑制效果好于大肠杆菌。因此，苦参生品及不同炮制品的醇提液和水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌效果。

关键词 苦参;生品;炮制品;提取方法;金黄色葡萄球菌;大肠杆菌;抑菌药效

中图分类号 R 285  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）06-0153-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.036

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Antibacterial Efficacy of Two Different Extraction Methods of Crude Products and Its Processed Products of  Sophorae flavescens

LU Ping-zhu1，CHANG Chu-rui2，LONG Qing-de2 （1.Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404100;2.College of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract Water decoction and ethanol reflux extraction were used to extract  Sophorae flavescens  and its processed products.The minimum inhibitory concentration （MIC） of  Staphylococcus aureus  and  Escherichia coli in vitro  was determined by Oxford cup method， and the effects of different extraction methods and processing methods on the antibacterial effect of  Sophorae flavescens  were studied.The results showed that the crude product extract and vinegar broiled product extract in the alcohol extract had a better inhibitory effect on  Staphylococcus aureus，  and the best antibacterial effect on  Escherichia coli  was the crude product extract， and the MIC value was 0.0125 g/mL;the roasted coke extract in the water extract had better antibacterial effects on  Staphylococcus aureus  and  Escherichia coli，  with MIC values of 0.1 and 0.2 g/mL， respectively.Among them， the antibacterial effect of alcohol extract was better than that of water extract;the inhibitory effect of alcohol extract on  Escherichia coli  was better than that of  Staphylococcus aureus; the inhibitory effect of water extract on  Staphylococcus aureus  was better than that of  Escherichia coli. Therefore， the alcohol extracts and water extracts of crude products and different processed products of  Sophorae flavescens  had antibacterial effects on  Staphylococcus aureus  and  Escherichia coli.

Key words  Sophorae flavescens; Crude product;Processed product;Extraction method; Staphylococcus aureus;Escherichia coli; Antibacterial efficacy

基金项目 贵州省科技计划项目（黔科合重大专项字〔2015〕6009-2）。

作者简介 陆平祝（1990—），女，侗族，贵州黎平人，讲师，硕士，从事分子生药学及中草药研发工作。

收稿日期 2021-05-24

中药苦参为豆科槐属植物苦参 （Sophorae flavescens  Ait.）的干燥根，又被称为苦骨、苦豆根、牛参、苦平子、野槐根等。苦参始载于《神农本草经》，将其列为中品，是我国历史悠久的传统中药之一。苦参味苦、性寒，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效;多用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、皮肤瘙痒、疥癣麻风、外治滴虫性阴道炎等外部皮肤疾病[1]。

随着现代科研技术的发展，重要学领域研究发现苦参中主要活性成分是生物碱类和黄酮类，这就是苦参具有抗肿瘤、抗心律失常、镇静催眠、抗肝纤维化等方面的药理作用原因[2-4]。除了以上提到的药理作用外，张爱君等[5]对苦参的消炎和抗菌效果进行研究，发现苦参碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌均有明显的抑制作用;桂蜀华等[6]通过苦参碱体外抗真菌试验发现苦参碱拥有较强的抗真菌活性;刘鹏飞等[7]研究发现苦参黄酮类成分具有抑菌、抗心律失常、抗氧化的作用;姚梅芬等[8]研究发现苦参中黄酮类化合物对细菌和真菌都有抑制作用，且对革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌，对单细胞真菌作用强于丝状真菌。因此，上述研究均能说明苦参确实具有抗菌消炎作用，并且苦参中的苦参碱和黄酮类物质是苦参抗菌消炎的主要活性物质。

大量研究表明苦参具有重要的抗菌消炎药用价值，且作为天然药物苦参在药理作用上有传统药物无法比拟的优势。随着近几年中药制剂的不断发展和苦参的抗菌消炎作用，苦参的药效研究始终作为近几年的热门课题，其中天然绿色动植物杀虫剂的开发使用是用药量最大的项目之一，妇科洗液、苦参针剂、抗菌的苦参泡腾片等一批疗效确切的药品用量稳固。苦参除广泛用于入药外，也是兽医名药，在畜牧业中应用广泛。笔者采用牛津杯法对苦参及炮制品的抗菌药效进行初步研究，旨在研究苦参不同提取方法、炮制方法的抗菌效果，研究和开发在畜牧业中应用的新型环保产品、药物，为苦参的临床使用提供安全、合理的用药依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株。

金黄色葡萄球菌 （ Staphylococcus aureus ，菌种编号ATCC25923） ;大肠杆菌 （Escherichia coli ，菌种编号ATCC25922）。

1.1.2 药材。苦参饮片购于万东桥药材市场，经贵州医科大学药用植物学与生药学教研室常楚瑞老师鉴定为苦参 （S.flavercens  Ait.）的干燥根。苦参炮制品参考相关文献进行炮制所得[9-12]。

1.2 试验方法

1.2.1 中药提取液制备。

1.2.1.1 醇提液制备。分别称取苦参生品及炮制品20 g，加85%乙醇浸泡0.5 h，于数显恒温电热套上80 ℃回流提取3次（加乙醇量分别为药材重量的10、8、8倍，回流提取时间分别为2、1、1 h），将提取好的药液合并，抽滤，浓缩至流浸膏，用60%DMSO定容至20 mL，药液浓度为1 g/mL，即每1 mL 药液中有1 g的苦参生药液（炮制品药液）粗提物。将苦参生品及炮制品醇提液进行梯度稀释，其浓度分别为0.500 00、0.400 00、0.300 00、0.200 00、0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 g/mL，冰箱4 ℃保存，备用[13-16]。

1.2.1.2 水提液制备。分别称取苦参生品及炮制品20 g，加85%水浸泡0.5 h，于数显恒温电热套上100 ℃回流提取3次（加水量分别为药材重量的10、8、8倍，回流提取时间分别为2、1、1 h），将提取好的药液合并，抽滤，浓缩至流浸膏，用60%DMSO定容到20  mL，即得药液浓度为1 g/mL，将苦参生品及炮制品水提液进行梯度稀释，其浓度分别为0.500 00、0.400 00、0.300 00、0.200 00、0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 g/mL，冰箱4 ℃保存，备用[17-20]。

1.2.2 阳性对照制备。

精密称定注射用青霉素钾0.001 g，实称0.001 2 g，加至10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，得到100 μg/mL青霉素钾溶液，冰箱4 ℃保存，备用。

1.2.3 培养基制备。

称取营养琼脂33 g，加蒸馏水1 000 mL，加热至溶解，置于锥形瓶中，经115 ℃灭菌30 min后，备用。

1.2.4 细菌混悬液制备。

用接种环将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接种于营养琼脂培养基，35～37 ℃培养24 h后用无菌生理盐水将营养琼脂培养基上的菌苔冲洗到锥形瓶中，在摇床上200 r/min振摇30 min。校正菌液浓度相当于0.5号麦氏标准比浊管（相当于菌液浓度为1.5×108CFU/mL），用无菌生理盐水将细菌混悬液稀释10倍备用，此时菌悬液浓度约为1.5×107CFU/mL，以上所有步骤均在超净工作台内完成[21]。

1.2.5 抑菌活性测定。该试验采用牛津杯法，并进行适当修改。具体方法是：将灭菌后的营养琼脂冷却至50 ℃左右，于超净工作台中紫外灭菌20～30 min后倾倒至无菌培养皿中，每个培养皿倾倒约20 mL。待培养皿内营养琼脂凝固后，用涂抹棒将适量菌液均匀地涂抹在平板上，以无液体在平板上流淌为好。将灭菌后的牛津杯用镊子夹出，垂直放置于制作好的含菌平板上，轻轻按压，使牛津杯底部与营养琼脂表面紧密贴合。每个平板内均放置6个牛津杯，将梯度稀释的苦参生品（炮制品）醇提液（水提液）分别加入牛津杯中，每种浓度提取液均加200 μL，中间的牛津杯中加入同等剂量的60%DMSO作空白对照。用配好的青霉素钾作为阳性对照（方法同上）。37 ℃培养24 h。观察试验菌生长情况，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。每种细菌对应苦参生品（炮制品）药液提取物的试验均重复3次，取平均值[22-26]。