同位素稀释-液相色谱-串联质谱快速测定猪肝中4种 β 2-受体激动剂残留

摘要 [目的]建立同位素稀释-液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）测定猪肝中沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺和氯丙那林的分析方法。[方法]样品经5%高氯酸水解后，加入固体缓冲剂，用乙酸乙酯-叔丁基甲醚（3∶2， V/V ）提取，氮吹复溶后，正己烷净化，采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱分离。[结果]沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林在0.25～10.00 μg/L线性良好（ r ≥0.997 5）;方法的定量限为0.50 μg/kg 。在3个添加水平下回收率为82.5%～109.7%，RSD为1.0%～12.2%。[结论]该方法灵敏、快速、准确，适用于猪肝中4种 β 2-受体激动剂快速定性和定量筛查。

关键词 液相色谱-串联质谱法;猪肝;沙丁胺醇;克伦特罗;莱克多巴胺;氯丙那林

中图分类号 S 851.34+7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）06-0168-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Determination of Residues of Four  β 2-agonists in Pig Liver by Isotope Dilution-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LU Li-liang， LIU Chang-yong， CHEN Yong-fa et al

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，Xinjiang Academy of Agriculture Reclamation Science， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract [Objective] To establish an analytical method for the determination of salbutamol， clenbuterol， ractopamine and cloprenaline in pig liver by isotope dilution-liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC/MS/MS）.[Method] The sample was hydrolyzed with 5% perchloric acid， and the solid buffet was added， and extracted with a mixture of ethyl acetate - tert-butyl methyl ether （3∶2，  V/V ） ， the extraction solution was dried under a stream of nitrogen ， and dissolved with initial moble phase， then purified with N-hexane.The target analytes were separated by the Agilent ZORBAX SB-Aq. [Result] The salbutamol， clenbuterol，ractopamine and clorprenalin had good linearity at 0.25-10.00 μg/L（ r ≥0.997 5）;the limit of quantification of the method was 0.50 μg/kg.The average recoveries at the three leves of addition were 82.5%-109.7%，RSD was 1.0%-12.2%.  [Conclusion] The method is sensitive， rapid and accurate， and is suitable for the rapid qualitative and quantitative screening of four  β 2-receptor agonists in pig liver.

Key words Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC/MS）;Pig liver;Salbutamol; Clenbuterol;Ractopamine;Clorprenalin

作者简介 鲁立良（1981—），男，安徽颍上人，高级实验师，硕士，从事食品质量安全检测研究。*通信作者，高级实验师，硕士，从事食品安全与工程研究。

收稿日期 2021-06-10

β 2-受体激动剂可松弛支气管平滑肌和抑制过敏反应介质释放，广泛应用于治疗支气管哮喘、支气管炎和肺气肿等呼吸疾病。因其具有营养“再分配效应”[1]，能抑制动物脂肪生成、提高饲料转化率和酮体瘦肉率，常被非法添加于饲料和饮水中，以促进畜禽生长，因而极易造成其在畜禽体内的蓄积，并通过食物链传递给人体，对人体的心血管和神经系统产生影响，引起肌肉震颤、心悸、恶心和心跳加快等症状，严重的甚至危及生命[2]。因此，许多国家都颁布了相关法令禁止将 β 2-受体激动剂用于动物饲养中。欧盟规定动物源性食品中不得检出 β -兴奋剂[3]，我国农业主管部门颁布的第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中将克伦特罗及其盐、沙丁胺醇及其盐和酯、西马特罗及其盐和酯等列为禁用兽药，规定在动物性食品中不得检出，并将包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、氯丙那林等在内的4种 β 2-受体激动剂列为年度监测计划。因此，研究和开发 β 2-受体激动剂的分析技术一直是研究的热点。

目前， β 2-受体激动剂的检测方法较多，主要有酶联免疫法（ELISA）[4-5]、高效液相色谱法（HPLC）[6]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[7]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[8-10]等。其中，HPLC-MS/MS因具有灵敏度高、检出限低、选择性好等特点，被广泛地应用于 β 2-受体激动剂的定性、定量测定。对于动物源性样品中 β 2-受体激动剂的前处理方法，主要采用 β -葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解的方式进行提取，水解时间长达16 h，长时间弱酸环境导致部分目标物回收率偏低[11-12]。 β 2-受体激动剂在肝脏具有较强的富集，监测其在肝脏中的含量可有效监控动物饲养过程中违禁药物的使用情况。但肝脏成分复杂，在使用HPLC-MS/MS检测时会有较强的基质干扰[13]，从而影响到结果的准确性。因此，通过优化样品前处理方法和质谱分析条件，对提高测定结果的准确性具有重要意义。

沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林是较为常见的4种 β 2-受体激动剂，也是农业农村部每年畜禽产品例行监测的重要风险因子。该研究以猪肝为基质，针对目前检测方法中存在的提取方法耗时长、步骤烦琐和基质效应等问题，采用操作简便的前处理技术，结合高效液相色谱-串联质谱和同位素内标法，建立一种快速、准确、灵敏的HPLC-MS/MS法测定猪肝中4种 β 2-受体激动剂，以满足日常的监督检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1260-6460 Triple Quad LC/MS液相色谱串联质谱仪，美国Agilent公司;N-EVAPTM112氮吹仪，美国Organomation Associates公司;3-30k高速冷冻离心机，美国Sigma公司;IKA MS3涡旋混合器，德国IKA公司;ULPHW-Ⅳ超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司。

1.2 试剂

乙腈、甲醇均为色谱纯，德国Merk公司;乙酸铵、甲酸、甲酸铵均为色谱纯，德国CNW公司;无水碳酸钾，分析纯，北京化工厂;碳酸氢钠，分析纯，陕西省西安化玻站;高氯酸，优级纯，天津市鑫源化工有限公司;试验用水为超纯水  ULPHW-Ⅳ超纯水制造系统制备。标准品沙丁胺醇、沙丁胺醇-D3、克伦特罗、克伦特罗-D9、莱克多巴胺、莱克多巴胺-D6、氯丙那林、氯丙那林-D7均购于上海安谱科技有限公司，分别用甲醇配制成10 μg/mL的混合标准工作液和内标溶液，-18 ℃储存。

1.3 样品处理

准确称取均质后的猪肝样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入8.0 mL 5%高氯酸（5∶95， V/V ）和陶瓷均质子一枚，涡旋2 min，于60 ℃水浴恒温箱中水解1 h，冷却至室温后10 000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中，加入1.50 g NaHCO3-K2CO3（4∶1， m/m ）和 15.0 mL 乙酸乙酯-叔丁基甲醚（3∶2， V/V ），涡旋振荡10 min，8 000 r/min 离心5 min，取上清液于50 ℃水浴氮吹至近干，用1.0 mL含0.1%甲酸的甲醇-水溶液（1∶9， V/V ）复溶，加入2 mL正己烷涡旋，离心，去除正己烷，下层水相再加入2 mL正己烷重复一次，取下层水相过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.4 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）;流动相A为含0.1%甲酸乙腈，B为含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸铵溶液;梯度洗脱，见表1;流速0.60 mL/min;进样量5.0 μL，柱温30.0 ℃。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）;扫描方式为正离子扫描;检测方式为多反应检测（MRM）;毛细管电压2 500 V;干燥气温度325 ℃，流速7 L/min;雾化气压力344.7 kPa;鞘气温度250 ℃，流速12 L/min;4种 β 2-受体激动剂的质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

由于 β 2-受体激动剂属于苯乙醇胺类化合物，含有氨基（-NH）结构，易与质子结合形成稳定的季铵盐结构，在ESI正电离模式下更容易获得H+而形成[M+H]+准分子离子峰。首先，在ESI+模式下，分别对100 ng/mL 的4种 β 2-受体激动剂及其氘代物的标准溶液进行一级质谱全扫描分析，获得每种化合物的母离子，并优化离子传输毛细管出口电压，使母离子的传输效率最高，碎片离子产生最少，然后再对这些母离子进行全扫描分析，通过调整碰撞能量为每个化合物选取2个质谱响应最佳的特征碎片离子作为子离子，优化后的质谱参数见表2。

2.2 流动相的选择与优化

参考标准[14]，该试验选择乙腈作为流动相的有机相。比较了水和0.1%甲酸水作为水系流动相时对4种 β 2-受体激动剂分离效果的影响，结果表明，以乙腈-水作为流动相时，4种化合物出峰时间较快，且沙丁胺醇色谱峰型较宽，而以乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，4种化合物的色谱峰出峰时间后移，沙丁胺醇峰型变窄。流动相中加入一定量的甲酸，可促进化合物的电离，提高其离子化效率和灵敏度，并改善峰型。

该试验进一步考察了在流动相中添加盐对4种化合物分离效果的影响，分别比较了乙腈-0.1%甲酸水（含5 mmol/L 乙酸铵）、乙腈-0.1%甲酸水（含5 mmol/L甲酸铵）、乙腈-0.1%甲酸水（含10 mmol/L 甲酸铵）、乙腈-0.1%甲酸水（含20 mmol/L甲酸铵）、乙腈-0.1%甲酸水（含50 mmol/L甲酸铵）5种流动相体系。结果表明，在流动相添加铵盐可以使色谱峰型变窄、对称，且甲酸铵的效果好于乙酸铵。随着甲酸铵浓度的增加，色谱峰形无明显变化，但高浓度的盐会对色谱柱和质谱系统造成损伤。故该试验选择乙腈-0.1%甲酸水（含5 mmol/L甲酸铵）为流动相，4种 β 2-受体激动剂及其同位素内标空白基质溶液（5 μg/kg）的MRM 色谱图见图1。