中药药敏试验新方法及68种中药对克氏原螯虾病原菌的抑菌活性研究

摘要 为消除中药颜色和不溶颗粒对最小抑菌浓度测定结果判定的影响，建立了微量肉汤稀释联合平板计数法。结果发现，抗菌剂（磺胺甲噁唑、多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、恩诺沙星）MIC测定前后的MIC孔细菌浓度比值（BCRMIC）为10-3～103。以BCRMIC为标准替代肉眼观察来判定中药MIC，采用微量肉汤稀释联合平板计数法定量评价了68种中药的抗菌活性。五倍子、黄连、山楂、地锦草、厚朴、黄芩、石榴皮、翻白草、乌梅对克氏原螯虾源病原菌（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌）的抗菌活性较强，其MIC为4～16 mg/mL。

关键词 中药;最小抑菌浓度;大肠杆菌;气单胞菌;柠檬酸杆菌;克氏原螯虾

中图分类号 S 945.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0087-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on A New Method for Drug Susceptibility Test of Traditional Chinese Medicine and Antibacterial Activity of 68 Kinds of Traditional Chinese Medicine against Pathogenic Bacteria of Procambarus clarkii

ZOU Wen-teng，PENG Kai-song， ZHANG Zi-han et al

（Laboratory of Aquatic Health and Public Health， Department of Fisheries， College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract In order to eliminate the  influences of the color and insoluble particles of traditional Chinese Medicine on the determination of minimal inhibitory concentration （MIC） of traditional Chinese medicine， the micro broth dilution combined with plate counting method （MBD&PCM） was established. The results showed that the bacterial concentration ratio （BCRMIC） in MIC cell before and after MIC determination of antibiotics （sulfamethoxazole， doxycycline， florfenicol， neomycin sulfate， enrofloxacin） was between 10-3 and 103.  The antibacterial activity of 68 kinds of traditional Chinese medicines was quantitatively evaluated by MBD&PCM， and BCRMIC was used as the standard instead of naked eye observation to determine MIC of traditional Chinese medicine. The antibacterial activity of 68 kinds of traditional Chinese medicine was quantitatively evaluated by MBD&PCM. Galla chinensis， Coptids rhizoma， Crataegi fructus， Euphorbia humifusae herba， Magnolia officinalis cortex， Scutellariae radix， Cranati pericarpium， Potentillae discoloris herba and Mume fructus had strong antibacterial activities against pathogenic bacteria （Aeromonas hydrophila， Aeromonas veronica and Citrobacter freundii） of Procambarus clarkii.

Key words Traditional Chinese medicine;Minimum inhibitory concentration （MIC）;Escherichia coli;Aeromonas sp.;Citrobacter sp.;Procambarus clarkii

细菌病是水产养殖业的重大威胁，每年给我国造成了数百亿元的经济损失。以前水产动物细菌病的防治主要依靠抗菌剂，但渔业临床病原菌的耐药性正逐年增加，抗菌药物的临床使用剂量也逐年加大，这会增加水产品质量安全的风险[1]。中药是中华民族的伟大瑰宝，其来源广泛、细菌不易产生耐药性、毒副作用小、无残留。中药替代抗菌剂防治水产动物细菌病具有突出优点和广阔前景[2]。普及中药在水产养殖上的应用，不仅符合国家减抗、替抗战略，而且将为保障舌尖上的安全作出突出贡献。

治疗水产动物细菌病的中药，可能通过抑制或杀灭细菌直接发挥作用，也可能通过调节宿主免疫机能或其他生理机能而间接发挥作用。在相同条件下定量评价不同中药对水产动物病原菌的抗菌活性，是渔用抗菌中药开发的第一步。中药抗菌活性定量评价方法有琼脂稀释法[3]、试管二倍稀释法[4]、微量肉汤稀释法[5]。琼脂稀释法需制备不同浓度梯度药液的琼脂平板，操作烦琐、工作量大。试管二倍稀释法中，中药用量大且不适于高通量测定。微量肉汤稀释法是国际、国内通用的抗菌剂最小抑菌浓度（MIC）定量测定方法[6]。该方法对MIC的判断是基于抗菌药物抑制细菌生长的孔澄清透明，未被抑制的孔浑浊，浑浊孔与澄清孔经肉眼观察即可区别开来。微量肉汤稀释法用于中药抗菌活性定量测定时，虽然具有中药用量少、操作简便快速、适于高通量测定等优点，但也具有中药提取液的颜色和不溶颗粒会干扰结果判读的缺点。因此，需要对微量肉汤稀释法进行改进，以克服中药颜色和不溶颗粒对结果判读的影响。

克氏原螯虾产业近年来发展迅猛，2019年全国养殖面积128.6万hm2，总产值达4 110亿元[1]。细菌病是克氏原螯虾产业的重大危害因素[7]。克氏原螯虾细菌病主要发生在捕捞上市期，执行抗菌剂休药期存在一定难度。中药适合添加到饲料中高温制粒、安全无残留的特性，特别适用于克氏原螯虾细菌病的防控。为了筛选适用于克氏原螯虾细菌病防控的中药，笔者以抗菌剂MIC孔在测定前后细菌浓度比值为MIC判定依据，先建立微量肉汤稀释联合平板计数的中药MIC定量测定方法，然后采用该方法测定68种常见中药对克氏原螯虾常见细菌性病原的体外抑菌活性，以期为中药抗菌活性定量评价和克氏原螯虾细菌病的中药防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌17J154、维氏气单胞菌18J032和弗氏柠檬酸杆菌17J144分离自克氏原螯虾，以上病原菌和大肠杆菌ATCC25922均由安徽农业大学动物科技学院水产系水生健康与公共卫生实验室保存[7]。磺胺甲噁唑、多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、恩诺沙星标准品购自中国兽药监察所。中药均购自合肥市蜀山区长江西路百姓缘大药房。

1.2 方法

1.2.1 中药水提液的制备。

取过80目筛的微粉中药各50 g放入烧杯，加500 mL蒸馏水充分浸透后浸泡4 h，60 ℃水浴1 h，沸水浴30 min，将药液和药渣经3层200目绢纱过滤压榨至无液体滴出，文火浓缩至512 mg/mL。115 ℃高温灭菌20 min后，4 ℃下保存备用。

1.2.2 微量肉汤稀释联合平板计数测定抗菌剂MIC孔测定前后细菌浓度比值。

参考欧盟药敏试验标准方法[6]进行MIC测定。取-20 ℃冻存的上述菌株，经MHA平板划线，大肠杆菌ATCC25922在37 ℃、其他致病菌在25 ℃下培养，挑取单菌落接种至MH肉汤，制备细菌储备液（用灭菌生理盐水洗涤菌体后，调整菌液OD625 nm至0.1，对应菌液浓度约为1×108～2×108 CFU/mL），10倍比稀释至104、105（欧盟标准浓度）和106 CFU/mL 3个数量级。采用平板计数法测定细菌工作液初始浓度，该浓度的1/2即为MIC孔测定前细菌浓度。

配制磺胺甲噁唑、多西环素、氟苯尼考、硫酸新霉素、恩诺沙星的药物储备液和药物工作液，在96孔板上依次进行药物工作液和细菌工作液的布板，同时设置阳性对照和阴性对照。96孔板在适温下培养16～18 h后，肉眼判读MIC。MIC结果读取后，立刻取MIC对应孔的菌液进行细菌平板计数，测定MIC读取时的MIC孔细菌浓度（即MIC孔测定后细菌浓度）。

MIC孔细菌浓度比值（bacterial concentration ratio of MIC well，BCRMIC）=（MIC孔测定前细菌浓度）/（MIC孔测定后细菌浓度）。

1.2.3 68种中药对克氏原螯虾病原菌的药敏试验。

为了消除中药颜色和不溶颗粒对MIC结果读判的影响，以抗菌剂的BCRMIC值为依据，参考欧盟药敏试验标准[6]，采用微量肉汤稀释法联合平板计数法测定试验中药的MIC和MBC。将上述细菌的储备液用MH肉汤稀释至104～106 CFU/mL数量级，并采用平板计数法测定细菌工作液初始浓度（即MIC孔测定前细菌浓度）。取96孔板，在A行各孔中加入200 μL中药提取液，B～F行各孔中加入100 μL无菌蒸馏水，从A行各孔中吸取100 μL移至B行各对应孔中混匀，依次稀释至F行后，弃100 μL混合药液。在除H行外的各孔中加入100 μL对应数量级的菌液，并在H和G行中分别加入100和200 μL MH肉汤作为对照，适温培养16～18 h。因为中药水提液颜色深、含有颗粒物，肉眼很难判读MIC值。培养完成后，取96孔板上除对照孔外的各孔菌液10 μL加入10 mL灭菌生理盐水中混匀稀释后，取0.1 mL涂布在MHA平板上，于适宜温度下培养24 h，计数，得到MIC测定后各孔细菌浓度。MIC孔测定后细菌浓度=BCRMIC×MIC孔测定前细菌浓度。满足上述条件的孔对应的最小中药浓度，即为该中药对该菌株的MIC。

2 结果与分析

2.1 抗菌剂MIC测定前后MIC孔细菌浓度比值

由表1可知，静止期慢效杀菌剂硫酸新霉素的BCRMIC在10-3～10-1数量级，静止期慢效抑菌剂磺胺甲噁唑的BCRMIC在101～102数量级，繁殖期快效抑菌剂多西环素的BCRMIC在100～101数量级，繁殖期快效抑菌剂氟苯尼考的BCRMIC在100～103数量级，繁殖期快效杀菌剂恩诺沙星的BCRMIC在100～101数量级。综上所述，以水产养殖用国标抗菌剂中具有代表性的5种抗菌剂为测试药物，测定的BCRMIC值均在10-3～103之间，这也符合理论上的预测。根据MIC测定原理，抗菌剂MIC测定前后MIC孔中菌液浓度比值（BCRMIC）可以类推应用于中药MIC的测定。