直播稻金粳818成熟胚遗传转化体系的建立

摘要 [目的]建立高效的金粳818成熟胚遗传转化体系。[方法]以直播稻品种金粳818成熟胚为外植体，设计4种诱导培养基，筛选适合金粳818的诱导条件;设计5种分化培养基，筛选适合金粳818的分化条件;获得的愈伤组织用农杆菌介导法进行转基因再生。[结果]最佳诱导培养基为4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D，诱导率为89.3%;最佳分化培养基为MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，分化率为81.1%，成苗率为52.1%;经PCR分子检测，再生幼苗100%为转基因阳性植株。[结论]该研究建立了金粳818成熟胚遗传转化体系，为品种定向改良奠定了技术基础。

关键词 金粳818;成熟胚;愈伤组织;遗传转化

中图分类号 S 511  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0100-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Genetic Transformation System of Mature Embryo of Direct Seeding Japonica Rice Variety Jingeng 818

LI Jun-ling， ZHANG Hong-lei， ZHANG Rong-xue et al

（Crop Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin 300384）

Abstract [Objective]To establish an efficient genetic transformation system of Jingeng 818. [Method]Using the mature embryo of direct seeding rice variety Jingeng 818 as explant， four induction medium schemes were designed to obtain the suitable induction conditions of Jingeng 818;five kinds of differentiation medium were designed to obtain the suitable differentiation condition for Jingeng 818; and the obtained callus was used to establish the transgenic regeneration system by agrobacterium mediated method. [Result]The results showed that the best induction medium was 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D with the induction rate 89.3%. The best differentiation medium was MS+5.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA with the differentiation rate 82.1% and the seedling rate 52.1%. By PCR molecular detection， 100% of the regenerated seedlings were transgenic positive plants.[Conclusion] In this study， the genetic transformation system of mature embryo of Jingeng 818 was established， which laid a technical foundation for directional improvement of varieties.

Key words Jingeng 818;Mature embryo;Callus;Genetic transformation

水稻是我国第一大口粮作物，水稻生产事关国家口粮安全。稻田杂草防除是生产中的棘手问题，由于禾本科杂草、杂草稻等与水稻亲缘关系较近，常规除草剂对其无效，培育具有除草剂抗性水稻品种能较好地解决稻田草害问题。金粳818是天津市水稻研究所选育的具有除草剂抗性的粳型常规水稻品种，为采用生物技术手段对金粳818进行改良而培育的新种质，可为除草剂抗性水稻提供新材料，其遗传转化体系的建立尤为重要。

利用愈伤组织再生体系进行水稻遗传转化是最广泛应用的方法之一，具有明显优点，如外植体来源广泛、周期短、易于转化、转化效率高等[1];农杆菌介导法是水稻遗传转化首选方法，具有易操作、低拷贝、基因沉默少、遗传稳定等诸多优势[2]。相比籼稻而言，粳稻愈伤诱导率和分化再生率较高，不少粳稻品种的组织培养再生体系已经建立且转基因体系成熟，如日本晴、中花11、秀水134等[3-7]。影响水稻愈伤组织诱导率、分化率和再生率的主要因素是基因型[8]，而品种间基因型的差异导致尚缺乏统一的配方适合所有品种。笔者以成熟胚为外植体，设计了4种不同诱导培养基摸索适宜诱导条件，设计5种分化培养基，利用获得的愈伤组织以农杆菌介导法进行转基因再生，建立高效的金粳818成熟胚遗传转化体系，为利用生物技术定向改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以天津市水稻研究所自主育成的金粳818成熟胚为外植体。含有pCAMBIA1301质粒的EHA105农杆菌由天津市农作物遗传育种重点实验室保存。培养基NB（货号N492）和MS（货号M519）及激素均购自Phytotechnology。

1.2 培养基

1.2.1 诱导培养基。基础培养基+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝胶+2，4-D（表1），调节pH为5.8。

1.2.2 筛选培养基。4.1 g/L NB+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+30 g/L蔗糖+3.5 g/L  植物凝胶+2 mg/L 2，4-D+40 μg/L潮霉素+400 μg/L青霉素，调节pH为5.8。

1.2.3 分化培养基。4.43 g/L MS+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L谷氨酰胺+0.3 g/L 水解酪蛋白+0.1 g/L 肌醇+30 g/L 山梨醇+30 g/L蔗糖+3.5 g/L 植物凝胶+30 μg/L潮霉素+300 μg/L青霉素+不同激素组合（表2），调节pH为5.8。

1.2.4 生根培养基。2.215 g/L MS+30 g/L蔗糖+3.5 g/L植物凝胶+20 μg/L潮霉素+200 μg/L青霉素，调节pH为5.8。

1.2.5 AAM侵染液。4.1 g/L NB+68 g/L蔗糖+36 g/L 葡萄糖+0.5 g/L水解酪蛋白+0.5 g/L L-脯氨酸+0.5 g/L L-谷氨酰胺+177 mg/L L-精氨酸+7.5 mg/L甘氨酸+300 mg/L L-天冬氨酸+2.5 mg/L 2，4-D，调节pH为5.2，使用前加入0.5 mL浓度为20 mg/L乙酰丁香酮。

1.3 方法

1.3.1 金粳818成熟胚愈伤组织诱导。收取当年新的金粳818成熟种子，剥离颖壳，取适量倒入50 mL离心管中，75%乙醇消毒1 min，30%次氯酸钠（有效氯3%）消毒15 min，无菌水冲洗5～6次，去除多余水分，倒入铺有3层灭菌滤纸的培养皿中，无菌风吹干15 min。最后接种到诱导培养基中，每皿25～35粒种子，28 ℃暗培养10 d，在水稻幼芽和成熟胚之间长出淡黄色、结构致密的胚性愈伤组织，掐芽剥离出愈伤后放入新的诱导培养基上3～5 d即可进行转化，诱导10 d后统计诱导率。

诱导率=出愈伤的成熟胚数量/总成熟胚数量×100%

1.3.2

农杆菌培养及浸染。将含有pCAMBIA1301质粒的农杆菌EHA105在YEP（含25 mg/L卡那霉素）固体平板上划线，28 ℃培养2 d。刮取平板上的农杆菌至AAM浸染液中，调整菌体浓度至OD600值为0.3～0.5，获得农杆菌悬浮液。挑取足够数量的愈伤组织放入无菌三角瓶中，加入农杆菌悬浮液，室温放置浸染20 min，并间隔晃动几次，倒掉菌液，将愈伤组织放置无菌滤纸上吸去多余菌液，转移至铺有一层无菌滤纸的固体培养基上，26 ℃黑暗培养3 d。

1.3.3 筛选培养。培养3 d后的愈伤组织，用无菌水清洗2次，用含有500 μg/mL羧苄青霉素的无菌水冲洗1次，吸去多余水分后将愈伤组织转移到无菌滤纸上，晾干，转移至筛选培养基上进行筛选培养，28 ℃，暗培养30 d。

1.3.4 分化再生。筛选30 d后，在原愈伤的底部可见颜色淡黄、结构致密、直径1～2 mm的阳性愈伤长出，挑取阳性愈伤到分化培养基上进行分化再生，培养条件为28 ℃，16 h光照/8 h黑暗培养。15～20 d统计分化率，25～35 d统计成苗率。

分化率=分化的愈伤组织数量/总愈伤组织数量×100%

成苗率=分化的幼苗数量/分化的愈伤组织数量×100%

1.3.5 生根培养及驯化。分化出的幼苗长到2～3 cm有明显根系时，转移到生根培养基上，培养条件28 ℃，16 h光照/8 h黑暗培养。7～10 d后，幼苗长出大量侧根，当小苗长至高10～15 cm时，打开盖子在室外炼苗2～3 d，取出小苗后洗去根部培养基，移栽至土中。

1.3.6 转基因植株鉴定。CTAB法提取幼苗DNA，并用潮霉素基因引物检测植株。

hygF：ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC

hygR：TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA

2 结果与分析

2.1 培养基和2，4-D浓度对愈伤组织诱导的影响

共设计4组诱导培养基，包含2种类型基础培养基和2种浓度2，4-D。试验结果表明，同一激素浓度下，NB培养基的诱导率高于MS培养基的诱导率，即Y3>Y1，Y4>Y2，且愈伤组织状态更好，无明显根毛，芽较短。同一基础培养基条件下，4和2 mg/L 2，4-D对愈伤诱导率差别不大。综上，适宜的诱导培养基为Y3（ 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D），诱导率为89.3%，且愈伤状态良好（表3和图1）。

2.2 不同浓度KT对愈伤组织分化再生的影响

设计了5种不同KT浓度分化培养基，金粳818愈伤组织在不同KT浓度分化培养基中分化成苗差异明显。试验数据表明，同一浓度NAA条件下，一定范围内KT浓度越高，分化率和成苗率越高，表现为F4>F3>F2>F1，KT浓度升高至6 mg/L，其分化率和成苗率反而有所下降。分化21 d时，F4处理绿点数量最多，个别愈伤组织分化出小苗（图2）。因此，适宜分化培养基激素配比为F4处理，即5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，可使分化率和成苗率分别达到81.1%和52.1%（表4）。