玉米逆境响应转录因子ZmGBF1的克隆及表达分析

摘要 从玉米中克隆了ZmGBF1基因，该基因长1 134 bp，编码377个氨基酸。进化树分析表明，玉米ZmGBF1与小麦TaGBF1、TuGBF3和高粱SbCPRF1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明，ZmGBF1在玉米胚芽鞘中表达量最高，叶片次之，根中表达量最低;ZmGBF1基因表达受到盐、干旱、高温、低温、脱落酸和水杨酸诱导，且在干旱和高温条件下ZmGBF1的表达量与对照相比呈显著差异，暗示ZmGBF1可能参与玉米对干旱和高温的响应过程。

关键词 玉米;ZmGBF1;非生物胁迫;表达分析

中图分类号 S 513  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0104-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of Stress Response Transcription Factor ZmGBF1 Gene in Maize

ZHU Ye-qing，SHEN Yi，KE Ke et al

（College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou， Hubei 434025）

Abstract ZmGBF1 gene was cloned from maize.The cDNA of ZmGBF1 contains 1 134 base pairs and encodes 377 amino acids.The phylogenetic tree analysis showed the ZmGBF1 was closely related to wheat TaGBF1，TuGBF3 and sorghum SbCPRF1.Real-time quantitative PCR analysis showed that ZmGBF1 expression was the highest in coleoptile，followed by leaf and lowest in root.Furthermore，ZmGBF1 was induced by salt，drought，high temperature，low temperature，abscisic acid and salicylic acid.The expression level of ZmGBF1 under drought and high temperature was significantly different with that of the control，strongly suggesting that ZmGBF1 might be involved in the responses to drought and high temperature in maize.

Key words Zea mays L.;ZmGBF1;Abiotic stress;Expression analysis

植物在生长发育过程中经常遭受病虫害等生物胁迫以及干旱、高盐、极端温度等非生物胁迫。当遭受逆境胁迫时，植物可以从形态结构及生理生化机制等方面发生一系列的改变，以达到适应和抵御逆境胁迫的目的[1]。在上述响应过程中，转录因子起着重要作用。作为重要的调控因子，转录因子可以接受上游信号，并通过其蛋白质结构上特殊的DNA 结合区与靶基因上游的顺式作用元件区域结合，进而激活或者抑制靶基因的表达。这种转录水平上的调控在植物逆境响应信号网络中发挥着重要作用[2]。在植物中有10%的基因编码转录因子，它们分别在植物不同发育阶段、不同环境条件下发挥调控作用[3]。在植物中至少有60个转录因子家族，但是只有少数家族成员如bZIP、NAC、MYB、WRKY和AP2/ERF等被证实参与生物及非生物逆境响应[4]。

利用MEME （multiple em for motif elicitation）分析工具，Foster等[5]根据bZIP转录因子序列相似性将拟南芥75个bZIPs分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和S类10个亚家族。GBF转录因子作为bZIP家族G组成员，已被证明与几个环境调节基因启动子区的G-box序列特异性结合[6-7]，其特征在于它们的C-末端碱性/亮氨酸拉链（bZIP） DNA结合结构域和N-末端富含脯氨酸的转录激活结构域[8]。大量研究表明，GBF类转录因子广泛参与植物的各种发育进程以及对外界生物和非生物胁迫的响应。有研究发现。该类基因受光调控诱导，如拟南芥GBF1、GBF2、GBF3是调节光诱导的RBCS-1A基因启动子的G-box结合蛋白[7，9];欧芹中CPRF-1能与CHS基因启动子的G-box结合，调节CHS基因的光诱导表达[10];小麦TaGBF2 基因介导了蓝光响应信号通路[11]。此外，GBF类转录因子还与抗逆响应有关，如小麦TaGBF2、水稻OSBZ8、水稻GBF4、草莓bZIP基因可以响应干旱调控的诱导[11-14];过表达EcGBF3、AtGBF3拟南芥植株降低了对ABA的敏感性，提高了对渗透胁迫、盐分和干旱胁迫的耐受性[15];250 mmol/L NaCl模拟盐胁迫24 h后，2种不同籼稻基因型Rasi和Tellahamsa中OsGBF1的表达均有不同程度的上调表达[16];拟南芥中GBF1通过调节CAT2表达和细胞内H2O2含量参与植株衰老过程的调节[17]。

前期工作中，笔者通过Bulked-RNAseq分析了玉米不同干旱响应类型的自交系，结果发现ZmGBF1（GRMZM2G011932）基因强烈响应干旱信号，暗示其可能在玉米干旱信号转导过程中起重要作用[18]。为深入探究基因ZmGBF1的功能，该研究首先对ZmGBF1进行生物信息学分析，同时运用qRT-PCR技术分析该基因在高温、低温、盐、干旱、脱落酸以及水杨酸处理下的表达特性，以期为深入研究玉米基因ZmGBF1的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

以玉米自交系B73为试验材料，选取大小一致的种子，1%次氯酸钠消毒5  min，蒸馏水冲洗3次，种子置于28 ℃培养箱进行催芽。将发芽一致的种子放入1/4 Hoagland培养液中培养，每7 d更换2次培养液，培养至三叶期进行处理。采用20% PEG6000模拟干旱处理，用0.2 mol/L NaCl溶液进行盐处理，对照组均为正常培养，处理48 h后取样;对于低温处理，将幼苗转移至4 ℃光照培养箱;高温处理将幼苗转移至42 ℃光照培养箱，对照组均为正常培养，处理4 h后进行取样;激素处理采用0.1 mmol/L的ABA、SA进行叶面均匀喷施，每隔12 h喷施1次，对照组等效喷施蒸馏水，处理48 h后取样。每处理设置3个生物学重复，取样部位为幼苗的根、胚芽鞘、叶，液氮速冻后保存于超低温冰箱中。

1.2 玉米总RNA的提取及cDNA的合成

样品材料在液氮低温研磨后，参照宝日医生物技术（北京）有限公司TRIzol试剂产品说明方法进行总RNA的提取，用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。残留DNA的去除以及cDNA合成按照全式金公司试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）说明书进行。cDNA测定浓度后保存于-20 ℃待用。

利用Primer 5.0 分别设计引物，通过RT-PCR方法获得ZmGBF1基因片段。PCR体系为10 μL：cDNA（总DNA）0.5 μL，ddH2O 1.3 μL，2× buffer 5.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq 酶[5 U/（mol·L）]0.2 μL。PCR反应条件为94 ℃ 2  min，98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35个循环，68 ℃ 4  min。

1.3 玉米ZmGBF1基因表达量分析

采用qRT-PCR技术分析玉米ZmGBF1基因的相对表达量，选取玉米GAPDH基因为内参基因，ZmGBF1基因及内参基因的上下游引物序列通过Primer 5.0软件设计（表1）。试验所使用的SYBR Green I荧光标记染料是购于生工公司的SGExcel FastSYBR qPCR 预混液，荧光定量PCR仪型号为AriaMx。反应条件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s;40个循环。每个样品设置3个技术重复，采用2-△△Ct法计算相对表达量水平。

1.4 玉米ZmGBF1基因的生物信息学分析

在线工具Expasy ProtParam[19]（https：∥web.expasy.org/protparam/）用于对ZmGBF1蛋白特性进行预测分析，使用DNAMAN 9.0软件进行序列比对，使用MEGA-X[20]软件进行进化树的构建，使用在线工具InterProscan[21]（http：∥www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）分析ZmGBF1蛋白结构域，蛋白二级结构预测分析则采用在线工具SOPMA（https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），TMHMM Server v.2.0（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用于跨膜结构分析，ProtScale（https：∥web.expasy.org/protscale/）用于分析ZmGBF1蛋白的亲疏水性，NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1/）则用于进行磷酸化位点预测分析。

2 结果与分析

2.1 玉米ZmGBF1蛋白的基因克隆及序列分析

分析RT-PCR产物测序后的结果，在NCBI中比对结果表明，该序列与其他物种的GBF序列相似性最高，于是命名该序列为ZmGBF1，并在NCBI中登录，登录号为JX469957.1。进一步分析表明，该序列含有1个长度为1 134 bp的开放阅读框，上游有1个起始密码子ATG，下游有1个终止密码子TGA，表明该序列是1个全长的基因。

ProtParam在线分析显示，ZmGBF1编码377个氨基酸，其分子式为C1728H2762N502O573S12，分子质量40 122.68，等电点为7.11，消光系数26 025，不稳定系数64.81（>40），为不稳定蛋白，总平均亲水性-0.678，属于亲水性蛋白（图1a）。InterProscan在线分析显示，ZmGBF1含有MFMR和bZip-plant-GBF1结构域，分别位于氨基酸1～92和249～297位置。NetPhos 3.1在线分析显示，ZmGBF1中有39个Ser磷酸化位点，17个Thr磷酸化位点（图1b）。SOPMA在线分析显示，ZmGBF1的二级结构中含有的α螺旋约占28.65%，β转角约占1.59%，延伸链约占4.51%，其余的246个氨基酸为无规则卷曲（图1c）。

2.2 玉米ZmGBF1的蛋白同源性及进化树分析

从GenBank网站下载了来自玉米和其他植物中若干个ZmGBF1同源蛋白和非生物胁迫相关的GBF转录因子的氨基酸序列。NCBI蛋白序列比对结果表明，ZmGBF1编码的氨基酸序列与高粱（Sorghum bicolor）CPRF1、普通小麦（Triticum aestivum）GBF1以及乌拉尔图小麦（Triticum urartu）GBF3序列相似度较高，相似性分别达87.96%、69.37%和64.66%。用DNAMAN软件将ZmGBF1蛋白序列与其他物种进行蛋白同源性比对分析（图2），结果显示，在小麦、水稻、拟南芥、藜麦以及穇子中都存在类似结构，其序列中都含有保守的GBF1结构域，暗示它们具有相似的功能。