高效液相色谱-串联质谱法快速测定鸡肉中阿奇霉素残留

摘要 [目的]建立高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中阿奇霉素残留的检测方法。[方法]鸡肉样品采用乙腈提取后，加入5 g NaSO4，盐析后，用饱和乙腈正己烷溶液去除脂质层。净化后，采用Waters C18（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）色谱柱分离，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，基质标准曲线结合外标法定量。[结果]阿奇霉素在1.0～200.0 μg/L线性关系良好（R2=0.999）。在添加量为5、10、50 μg/kg时，平均回收率分别为83.2%、91.2%、99.4%，相对标准偏差（RSD）分别为4.56%、4.72%、5.31%。[结论]该研究建立的方法精密度、准确度较高，选择性好，操作简便，适用于鸡肉中阿奇霉素残留的日常监测。

关键词 高效液相色谱-串联质谱法;阿奇霉素;鸡肉

中图分类号 S 859.84  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0182-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.045

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Determination of Azithromycin Residues in Chicken by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Li1， XU Shu-fei2， WANG Xiao1 et al

（1. Zaozhuang Customs， Zaozhuang，Shandong 277100;2. Penglai Customs， Penglai，Shandong 265600）

Abstract [Objective]To develop a method for determination for azithromycin residues in chicken by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. [Method]Chicken samples were extracted with acetonitrile， added 5 g Na2SO4， salting out， and removal of lipid layer with saturated acetonitrile hexane solution. After purification， they were separated by Waters C18 （100 mm×2.1 mm×1.7 μm） chromatographic column， determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， and quantified by matrix standard curve combined with external standard method.[Result]Azithromycin had a good linear relationship between 1.0 and 200.0 μg/L （R2=0.999）.The recovery was 83.2%，91.2% and 99.4% when the dosage was 5，10，50 μg/kg，the relative standard deviation（RSD） was 4.56%，4.72% and 5.31%. [Conclusion]The method has the advantages of high precision， high accuracy， good selectivity， simple operation， and can be used for the daily monitoring of the azithromycin residues in chicken.

Key words High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Azithromycin;Chicken

阿奇霉素属于大环内酯类抗生素，临床上用于人上下呼吸道、泌尿道、皮肤及软组织感染和性传播疾病的预防和治疗，被农业农村部列为畜禽禁用兽药。目前，阿奇霉素（AZM）违规用于畜禽养殖，会影响畜禽疫病防治和畜禽产品安全，增加细菌产生耐药性的风险，威胁人类健康。虽然国家明令禁止，但养殖环节带来的经济效益受损，养殖户将抗生素添加于饲料中或通过其他途径使用，导致人用抗生素仍被滥用于畜禽，已成为威胁畜禽产品安全的新隐患[1]。

阿奇霉素的检测主要针对药物中阿奇霉素含量的定量，在国内外文献中阿奇霉素检测主要有薄层色谱法（TLC法）[2]、高效液相色谱法[3-11]、高效液相色谱质谱联用技术（HPLC-MS）[12-15]。TLC法灵敏度不高，易受显色剂和硅胶板的影响，应用较少;高效液相色谱法具有分离效能高、应用范围广等优点，但灵敏度不能满足检测需求;HPLC-MS联用技术可在用色谱分离的基础上，能进一步对有关物质的结构进行推测，准确度、灵敏度更高[16-17]。

动物源性食品中阿奇霉素残留量检测相关报道较少，汪金菊等[18]建立了一种柱前衍生高效液相色谱荧光法检测鸡肉组织中阿奇霉素残留量，以9-芴基氯甲酸酯（FMOC-Cl）为柱前衍生化试剂，用带有荧光检测器的高效液相色谱仪在激发波长265 nm、发射波长315 nm条件下测定其衍生物，试验表明阿奇霉素在0.04～5.00 μg/mL线性关系良好，提取回收率在76%以上;徐广伟等[19]利用高效液相-紫外法检测鸡肉组织中的阿奇霉素，采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-异丙醇-0.002 mol/L 磷酸氢二钠（60∶15∶25，V∶V∶V）为流动相，紫外检测波长 210 nm，样品用氯仿- 异丙醇（95∶5，V∶V）提取，氮气流吹干，加流动相溶解后进样，该方法血清中最低检测限为 0.02  μg/mL，组织最低定量限为 0.05 μg/g;韦何雯[20]建立了检测家禽鸡可食组织中阿奇霉素残留量的HPLC-MS/MS法，采用XDB-C18色谱柱，以0.1%甲酸-甲醇溶液（60∶40，V∶V）作为流动相，该方法最低检出限为0.001 μg/mL，阿奇霉素回收率在73.6%以上。粟有志等[21]建立了样品以乙腈提取，N-丙基乙二胺（PSA）净化，采用Zorbax Eclipse Plus C18柱（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）分离，以乙腈- 0.1% 甲酸溶液为流动相，液相色谱-串联质谱法测定了鸡肉、牛肉、猪肉、猪肝、鲤鱼、牛奶6种基质中阿奇霉素的残留。

该研究采用高效液相色谱-串联质谱法，建立测定鸡肉中阿奇霉素残留的快速检测方法，以期为出境动物源性食品中阿奇霉素的日常监测需求提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS8040三重四极杆液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）;均质仪（PT-MR1600E，美国Polytron Devices公司）;涡旋振荡仪（Lab Dancer，德国IKA公司）;高速冷冻离心机（5804R，德国艾本德公司）;高纯水发生器（Mili-Q Reference，美国Millipore公司）;0.22 μm有机滤膜、甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）;正己烷、无水Na2SO4（分析纯，中国医药集团）;试验用水为Milli-Q 超纯水;阿奇霉素100 μg/mL（农业部农产品质量标准研究中心）。

1.2 标准溶液配制

阿奇霉素用甲醇配成1.00 μg/mL的混合标准溶液（-18 ℃避光存放），用空白基质溶液稀释混合标准工作液，配制成1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的标准曲线系列溶液。.

1.3 样品处理

称取5.00 g（精确至0.01 g）的均匀试样，置于50 mL塑料离心管中，准确加入1.0 μg/mL内标工作液30 μL。加入5 g无水Na2SO4，15 mL乙腈溶液，涡旋30 s，振荡提取10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清液5 mL，加入10 mL乙腈饱和正己烷溶液，涡旋30 s，振荡提取10 min，10 000 r/min离心10 min，去除上层正己烷溶液，取下层乙腈溶液5 mL，氮吹至近干，加入初始流动相定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后，上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱为Waters C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;检测流动相B为乙腈（初始浓度15%），A为0.1%甲酸溶液;柱温40 ℃;进样量10.0 μL;流速0.4 mL/min。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

丙酮、乙腈、甲醇通常用作样品前处理提取溶剂，乙腈的通用性较强，在提取兽药极性范围和选择性上明显优于其他2种溶剂，并能消除脂质效应或使其最小化，该研究对此进行了对比试验，结果发现，提取溶剂为丙酮、乙腈、甲醇时，阿奇霉素提取效率分别为52%、83%、78%，所以该方法采用乙腈溶液作为提取液。

2.2 液相色谱条件的选择

2.2.1 进样量的选择。

试验分别选择进样5、10、20 μL，发现进样量为10 μL时，阿奇霉素标准物质色谱峰型较好，且灵敏度较高。阿奇霉素标准溶液在MRM模式下的总离子流图和离子色谱图见图1～2。

2.2.2 流动相的选择。

在流动相中加入甲酸可以在电喷雾正离子模式时提供H+，提高电离效果，所以选择在流动相中加入0.1%的甲酸。流动相的有机相选择时考察了甲醇、乙腈2种情况，发现阿奇霉素采用甲醇时色谱分离较好，梯度洗脱程序参见表1。

2.2.3 质谱条件的选择。

经过优化确定阿奇霉素的定量离子、定性离子、CE电压、碰撞能量等参数，最终确定的质谱条件如下：电离模式为电喷雾电离正离子模式（ESI+）;质谱扫描方式为多反应检测（MRM）;雾化器流量为氮气3.0 L/min;碰撞气为氩气;离子源接口电压为-3.5 kV;加热块温度400 ℃;DL温度250 ℃;干燥气流量为氮气15 L/min;阿奇霉素质谱参数见表2。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性范围、相关系数、定量限、回收率和精密度。

用空白基质为溶剂制备标准工作曲线溶液，上机进行测定，以目标物的质量浓度X（μg/L）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制工作曲线。结果显示，阿奇霉素在1.0～200.0 μg/L线性良好（R2=0.999），该方法的阿奇霉素的检出限为1 μg/kg，定量限为5 μg/kg。对待测化合物进行加标水平为5、10、50 μg/kg的回收试验，平行测定6次，平均回收率分别为83.2%、91.2%、99.4%，相对标准偏差（RSD）分别为4.56%、4.72%、5.31%，表明精密度和准确度符合相关要求。

2.3.2 样品检测。

为验证该方法的可靠性，用所建立的方法测定了鸡肉、鸡肝样品38批次，样品中阿奇霉素残留均小于定量限，质控样品中的回收率等指标均达到分析要求。

3 结论

该研究采用高效液相色谱-串联质谱法，建立了鸡肉中阿奇霉素兽药残留的快速分析方法。与传统的三重四级杆串联质谱法相比，该方法前处理方法简便，大大提高了检测效率，极大提高了方法定性的准确性和定量水平。综上所述，该研究建立的方法快速、准确、灵敏度高，适用于鸡肉中阿奇霉素兽药残留的快速测定，为鸡肉进行风险监控提供了一种有力的技术手段，也为食品安全监管提供有效保障。

参考文献

[1] DAVIS J L，GARDNER S Y，JONES S L，et al.Pharmacokinetics of azithromycin in foals after i.v.and oral dose and disposition into phagocytes[J].J Vet Pharmacol Ther，2002，25（2）：99-104.

[2] 余立，王俊秋，王国兰，等.薄层色谱法检测阿奇霉素及其有关物质[J].中国抗生素杂志，2001，26（3）：227-229.

[3] 侯金凤，寇晋萍，王光裕，等.乳糖酸阿奇霉素注射液质量评价[J].中国抗生素杂志，2019，44（3）：320-326.