利用双重数字PCR方法检测进口粮谷中携带地肤的EPSPS基因拷贝数

摘要 建立了双重数字PCR检测地肤EPSPS基因拷贝数的方法，对进口粮谷中携带的8个地肤样品进行检测，发现2个样品的EPSPS相对拷贝数小于1，6个样品EPSPS相对拷贝数大于5，其中一个样品EPSPS相对拷贝数高达45.67。由此可见，进口北美粮谷携带抗草甘膦地肤的比例很高。

关键词 双重数字PCR;地肤;EPSPS基因拷贝数;进口粮谷

中图分类号 S 41-3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）09-0179-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.044

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Application of Duplex Droplet Digital PCR for Detection of EPSPS Gene Copy Number of Kochia scoparia in Imported Grains

WU Jing， FU Jian-guo，LIU Xiao-yu et al

（Nanjing Customs Animal Plant and Food Inspection Center， Nanjing，Jiangsu 210014）

Abstract A double digital PCR method was established to detect the EPSPS gene copy number of Kochia scoparia. Eight samples of Kochia scoparia carried in imported grains were detected.It was found that the relative copy number of EPSPS of 2 samples was less than 1， the relative copy number of EPSPS of 6 samples was greater than 5， and the relative copy number of EPSPS of one sample was as high as 45.67.It can be seen that the proportion of imported North American grains carrying glyphosate-resistant kochia is very high.

Key words Double digital PCR;Kochia scoparia;EPSPS gene copy number;Imported grain

草甘膦是一种非选择性的灭生除草剂，由于其具有杀草谱广、毒性低、安全性好、低土壤残留等特点，在全世界广泛推广应用，为全球农业生产作出了巨大贡献[1]。随着抗草甘膦转基因农作物在世界范围内的推广应用，全球农业生产者对草甘膦的依赖日益增加，从而导致草甘膦的使用量迅猛增长。由于长期单一使用草甘膦，对草甘膦产生抗药性的杂草不断出现，目前已有45种杂草被报道对草甘膦产生了抗药性[2]，对全世界的农业生产及生态环境安全都造成了巨大危害。

在北美地区，地肤是一种外来杂草，20世纪80年代已经在加拿大和美国西部地区广泛分布[3]，可对当地小麦及甜菜造成30%～60%的减产[4]。随着化学除草剂的长时间应用，地肤已对多种除草剂产生抗药性[5]，北美多地作物田已报道发现抗草甘膦地肤[6-8]。

我国每年从北美进口大量的转基因粮谷，其中携带大量的杂草籽，包括地肤。在进口粮谷中很可能含有抗草甘膦的地肤种群，一旦这些抗药性地肤在卸载、运输或加工的某个环节发生逃逸并在我国传播扩散，势必会影响我国农业生产和生态环境安全。因此，在进口过程中对地肤的抗药性进行检测，有助于对抗草甘膦地肤进行监测和防控。

植物对除草剂的抗性有多种，包括作用靶点抗性、非靶点抗性和代谢解毒等[1]。Wiersma等[9]研究发现，地肤的抗药性主要为靶标基因5-烯醇式-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的扩增，EPSPS基因的拷贝数与地肤的草甘膦抗性成正比，拷贝数越高，抗药性越强。因此，通过检测EPSPS基因就可以快速检测进口粮谷中携带地肤的草甘膦抗性。Wiersma等[9]建立了地肤EPSPS基因的荧光定量PCR检测方法，由于该方法只是相对定量，受扩增效率、反应体系、计算方法等多方面因素影响，精确性并不高。近年来，数字PCR技术快速发展，相对于荧光定量PCR技术，其具有准确度和灵敏度高、绝对定量等优点[10]。为了加强对进口粮谷中携带地肤的草甘膦抗性的检测，该研究建立了快速、准确的双重数字PCR检测方法，实现对地肤抗药性EPSPS基因的精准检测。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料均来自进口粮谷中截获，详细信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取。

挑取地肤种子1～10粒，放置于2 mL的EP管中，加入少许石英砂和2颗直径5.55 mm的钢珠，放入振动研磨仪（Retsch MM400）中研磨1 min。研磨后的样品使用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）进行DNA提取，提取方法参照试剂盒使用说明。DNA浓度和质量使用NanoDrop 1000进行检测。

1.2.2 引物及探针合成。

目标基因EPSPS引物和探针的设计根据GenBank上发布的地肤EPSPS序列（KJ374721.1），正反向引物和探针序列分别为DF-EPSPS-FP：AACATTTGCGTGCCATTGAT;DF-EPSPS-RP：ACCGTCTCTGATAGCTGTGGG;DF-EPSPS-P：VIC-CGATGACTCTTGCTGTTGTTGCCCTA-BHQ1。内参基因ALS引物和探针的设计根据GenBank上发布的地肤ALS基因序列（EU517498.1），正反向引物和探针序列分别为DF-ALS-FP：CTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTT;DF-ALS-RP：CCCAGTCAACTCGACGA-ATT;DF-ALS-P：FAM-ACCCGCCTCCCACATACAACACA-BHQ1。

1.2.3 数字PCR扩增。

1.2.3.1

数字PCR探针法体系（20 μL）。ddPCR supermix 10 μL、 2对引物和2个探针各0.5 μL、ddH2O 6 μL、DNA模板1 μL。

1.2.3.2

数字PCR微滴生成。使用QX200 Droplet Digital PCR系统（Bio-Rad），将20 μL样品反应体系加至DG8 cartridge中间一排8个孔内，在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70 μL微滴生成油，盖上胶垫，平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴于DG8 cartridge最上面一排孔内;将微滴液体移至96孔板内（约40 μL），在96孔板上盖封口膜，红色标记线朝上，在预热好的PX1热封仪内进行封膜（180 ℃，10 s），封好膜之后的96孔板放入PCR仪中进行扩增反应。

1.2.3.3

数字PCR扩增程序。95 ℃，10 min预变性;94 ℃变性30 s，58 ℃退火 60 s，40个循环;98 ℃热失活 10 min。

1.2.4 基因拷贝数检测。

PCR扩增结束后将 96 孔板置入QX200 Droplet Reader微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，先做一次Prime后再做Flush System，之后对96孔板中样品信息进行设定，完成后进行自动分析，人工核实后保存结果。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取

受样品量限制，用于提取DNA的地肤种子粒数、大小、成熟度、来源、保存时间等均存在差异，获得的DNA浓度也存在差异，最低为0.73 ng/μL，最高为9.72 ng/μL（表2）。

2.2 EPSPS基因拷贝数

20 μL的数字PCR反应体系中，每份样品的DNA用量及检测出的EPSPS和ALS基因的拷贝数见表2。根据数据结果可以看出，样品的重复性较好。由于不同样品的EPSPS基因扩增量不同，样品之间EPSPS拷贝数差异较大，20 μL的反应体系中，EPSPS最高拷贝数为7 360，最低拷贝数为14，平均拷贝数为2 978，而内参基因ALS的一致性相对较好，最高拷贝数为532，最低拷贝数为22，平均拷贝数为260。

利用EPSPS的拷贝数除以ALS的拷贝数，就可以获得地肤抗药性基因EPSPS的相对拷贝数（图1）。从图1可以看出，EPSPS相对拷贝数的重复性较好，201800470和2111000266这2份地肤样品的EPSPS相对拷贝数小于1，而其他6份地肤样品的EPSPS相对拷贝数均大于5，其中2111000832美国大豆中的地肤EPSPS相对拷贝数高达45.67。

2.3 数字PCR的灵敏度

选取样品2111001496的DNA原液进行梯度稀释，调整数字PCR反应体系中DNA终浓度分别为0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.010 00、0.001 00、0.000 10和0.000 01 ng/μL，数字PCR的结果见图2和图3。从图2可以看出，数字PCR的灵敏度很高，在20 μL浓度为0.000 01 ng/μL样品DNA中也可以检测出EPSPS基因的拷贝数为2。

3 讨论

杂草对草甘膦产生抗药性的机理有多种，EPSPS基因拷贝数的增加是其中最为重要的一种形式。目前已发现地肤、长芒苋、牛筋草等杂草对草甘膦产生抗药性与EPSPS的扩增相关[11]。Vila-Aiub等[12]研究发现，EPSPS与ALS相对拷贝数为53的长芒苋种群，在2 000 g/hm2高剂量草甘膦处理后，仍然有95%的存活率。Gaines等[13]建立了地肤EPSPS基因拷贝数与草甘膦抗性的相关性模型，利用EPSPS基因拷贝数检测方法来替代生物学检测方法，既快速又节省费用。

从现有文献来看，对EPSPS相对拷贝数的检测均使用实时荧光定量PCR方法，利用EPSPS基因和内参基因ALS的CT值的差异（CT=CTEPSPS-CTALS）来计算EPSPS的相对拷贝数[14]。由于荧光定量PCR通常会受到扩增效率的影响，EPSPS和ALS是在不同的反应体系中扩增，2个反应体系中模板浓度或其他条件只要有微小差异，就会对CT值的精确性和重复性造成影响。因此，利用荧光定量PCR检测基因拷贝数并不十分精确。而该研究利用双重数字PCR技术，解决了上述不足，既可以在同一PCR体系中扩增，又可以直接检测出目标基因和内参基因的绝对拷贝数，检测的精确性和重复性好于荧光定量PCR方法。另外，数字PCR的灵敏度也特别高，浓度为0.000 01 ng/μL也可以检测到EPSPS阳性拷贝。

Wiersma等[9]检测地肤抗性种群中基因EPSPS和ALS相对拷贝数为3.1～8.5，Gaines等[13]报道的抗性地肤种群的EPSPS和ALS相对拷贝数为15～20。该研究检测出地肤EPSPS的相对拷贝数最高为45.67，如果按照抗药性水平与EPSPS拷贝数正相关来推测，目前所测进口粮谷中地肤的抗药性水平比之前报道的抗性种群高很多。该研究仅挑取了8批次粮谷中的地肤进行试验，其中就有6批次中地肤的EPSPS相对拷贝数大于5，分别来自美国大豆、美国高粱和加拿大大豆，说明抗药性地肤已经在北美农作物田广泛分布。因此，应关注和重视进口粮谷中抗药性杂草的检测。

参考文献

[1] 陈世国，强胜，毛婵娟.草甘膦作用机制和抗性研究进展[J].植物保护，2017，43（2）：17-24.

[2] 俞蕴馨，伏建国，李井干，等.全球抗草甘膦杂草的发生概况与检疫思考[J].植物检疫，2020，34（5）：21-27.