一株胶冻样芽孢杆菌培养条件的优化及其解钾活性

摘要  [目的]优化该胶冻样芽孢杆菌培养条件及测定其解钾活性。[方法]用火焰光度计法测定胶冻样芽孢杆菌的解钾量;通过大白菜的田间试验验证解钾功能;通过培养基成分及培养条件的优化，获得最佳培养基和培养条件。[结果]用火焰光度计法测定胶冻样芽孢杆菌的解钾量为121.3 mg/L，其解钾率为12.06%;将其应用到喜钾作物大白菜上，通过大白菜的田间试验，与K0（空白对照）组相比大白菜产量增加了15.5%，与只加硫酸钾的K1相比，产量差异不大;通过培养基成分及培养条件的优化，获得最佳培养基配比为蔗糖1.0%、酵母浸粉0.1%、硫酸镁0.02%、磷酸氢二钾0.05%，最适培养条件为温度30 ℃、pH 7.0、转速200 r/min，发酵结果有效活菌数达到17.5×108 CFU/mL，芽孢率≥95%，解钾率提高到23.02%。[结论]该胶冻样芽孢杆菌可以将土壤中不可直接被作物吸收利用的钾素分解为作物可以直接利用的速效钾形态。

关键词 胶冻样芽孢杆菌;火焰光度计法;培养条件;优化;解钾率;有效活菌数;芽孢率

中图分类号 Q93-335  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）12-0011-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.003

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of the Culture Condition of a Jelly-like Bacillus Strain and Its Potassium-releasing Activity

YE Wei-wei，YANG Xiao-yan，WEI Shan-qiang et al

（Shandong Jinniu Biotechnology Co.， Ltd.， Jinan， Shandong 250000）

Abstract [Objective] To optimize the culture conditions of the jelly-like Bacillus strain and determine its potassium-releasing activity.[Method] The potassium solubilization amount of Bacillus jelly was determined by flame photometer;the potassium solubilization function was verified by the field test of Chinese cabbage;the best medium and culture conditions were obtained through the optimization of medium composition and culture conditions.[Result] The amount of potassium release of Bacillus jelly measured by flame photometer was 121.3 mg/L， and the potassium release rate was 12.06%. It was applied to the potassium-loving crop Chinese cabbage，through the field test of Chinese cabbage，compared with the K0 （blank control） group， the yield of Chinese cabbage increased by 15.5%;compared with K1 with only potassium sulfate， there was little difference in yield. Through the optimization of the medium composition and culture conditions， the best medium ratio was obtained sucrose 1%， yeast extract 0.1%， magnesium sulfate 0.02%， dipotassium hydrogen phosphate 0.05%， the most suitable culture conditions were temperature 30 ℃， pH 7.0， rotation speed 200 r/min， the effective number of viable bacteria reaches 17.5×108 CFU/mL as a result of fermentation， the spore rate was ≥95%， and the potassium solution rate was increased to 23.02%.[Conclusion] The Bacillus jelly can decompose the potassium in soil that cannot be directly absorbed by crops into quick-acting potassium forms that can be directly used by crops.

Key words Bacillus jelly;Flame photometer method;Culture condition;Optimization;Potassium solution rate;Effective number of viable bacteria;Spore rate

钾是农作物生长所必需的营养元素之一，其以离子态或可溶性盐类被吸附在原生质表面上而存在于高等植物中，起着促进蛋白质的合成、光合作用的进行和催化重要的酶促反应等重要作用。我国耕地土壤中蕴含着丰富的钾元素，但95%的钾存在于钾长石和云母这两类矿物中，不能被植物直接有效利用[1]。近年来随着土壤养分的失衡，耕地中的速效钾含量也以2 mg/（kg·a）的速度损耗;又因化肥的过量施用，造成一些钾被土壤固结，形成各种化学盐分，在土壤中积累，造成土壤养分结构失调、物理性状变差。钾元素已经成为农作物生长的限制因子[2-4]，因此，如何让土壤中含钾硅酸盐矿物转化为可被作物直接吸收利用的速效钾形态，从而提高土壤中的速效钾含量，成为未来农业科技研究的发展方向之一。

1939年，亚历山大罗夫从土壤中分离筛选出一种可以分解正长石和磷灰石并释放出钾元素和磷元素的细菌，将其命名为硅酸盐细菌，一些研究学者又称为钾细菌或胶质芽孢杆菌[5-6]，后来我国一些学者把这些解钾菌统称为解钾微生物。解钾微生物（potassium-solubilizing microorganism）是能够在土壤中或纯培养条件下，将含钾矿物如长石、云母等不能被农作物吸收利用的矿物态钾分解产生水溶性钾的微生物[7]。土壤中的解钾微生物在世界各地不同土壤中分布广泛，研究报道较多的有环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）、胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢杆菌（B.daphicus），其中最常见的为胶质芽孢杆菌。胶质芽孢杆菌又称胶冻样芽孢杆菌，一些分类学学者将胶冻样芽孢杆菌归为芽孢杆菌属，1993年Ash等[8]通过对芽孢杆菌属51个种的16S rRNA基因序列及其他相关研究发现胶冻样芽孢杆菌归为另一新属，并命名为类芽孢杆菌属（Paenibacillus），因此胶冻样芽孢杆菌又称为胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）。Ross等[9]研究认为胶冻样类芽孢杆菌可以在含有钾长石粉的无氮培养基上生长，说明胶冻样芽孢杆菌具有解钾功能。

笔者前期从土壤中筛选到一株胶冻样芽孢杆菌，通过火焰光度计法测得该菌株的解钾率，并通过种植喜钾作物的田间试验再次验证了该菌株的解钾功能;然后采用单因素试验和正交试验对其培养基成分、发酵工艺条件进行优化，获得了最佳培养基及发酵条件，并通过50 L发酵罐进行中试验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）由山东劲牛集团股份有限公司分离并保存。矿物材料购买钾长石粉。

1.2 培养基

斜面培养基为无氮培养基，其组成成分为葡萄糖10 g/L、磷酸氢二钾0.2 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钠0.2 g/L、硫酸钾0.2 g/L、碳酸钙5 g/L、琼脂粉18 g/L。基础培养基为无氮培养基，其组成成分为葡萄糖10 g/L、磷酸氢二钾0.2 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钠0.2 g/L、硫酸钾0.2 g/L、碳酸钙5 g/L。

1.3 试验方法

1.3.1 胶冻样芽孢杆菌菌种活化及发酵培养方法。

（1）斜面活化培养。将-20 ℃保存的菌种转接到斜面培养基，30 ℃，培养48 h。

（2）摇瓶发酵培养。无菌条件下将活化好的菌种接入发酵培养基，30 ℃、200 r/min振荡培养20 h即为种子液，同样无菌条件下，将种子液以2%的接种量接入500 mL三角瓶中，摇瓶装液量为20%，30 ℃，200 r/min振荡培养，每隔12 h检测一次，48 h结束培养，重复培养3次。

（3）50 L发酵罐发酵培养。以5%的接种量将种子液（摇瓶发酵20 h）接种于发酵罐中，30 ℃培养，转速200 r/min，通气量为3.3 L/min，发酵60～72 h，芽孢率≥95%视为发酵结束。

1.3.2 活菌计数及芽孢率分析方法。

活菌计数采用平板计数法[10-11]，芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数计算。

1.3.3 实验室解钾率的测定。

依据王珣珏等[12]解钾菌解钾效率检测方法的比较发现，经过6%H2O2消煮后，用火焰光度计所测钾含量包括菌体吸附钾、部分细胞内钾及溶液中游离态钾[13]所测得的溶液中K+质量浓度和解钾率是4种处理方法中得到的结果最准确的，因此选用培养基经H2O2处理后测钾的方法用火焰光度计测定该菌株的解钾能力。首先配制好系列钾标准溶液，绘制钾标准曲线，再在火焰光度计上测定待测液的速效钾含量[14]。将摇瓶发酵种子液以2%的接种量接种到100 mL含1 g钾长石粉的缺钾培养基中，以加入等量无菌水为空白对照，30 ℃，200 r/min，摇床振荡培养7 d;取培养液10 mL，加入2 mL 6%H2O2，在沸水浴中消化1 h，取消化液13 000 r/min离心5 min，取上清在火焰光度计上测定K+浓度。解钾率计算公式如下：

解钾率=X1-X0M×W×2×104×100%（1）

式中，X1为待测液速效钾含量（mg/L）;

X0为空白对照钾含量（mg/L）;

M为钾长石粉重量（g）;

W为钾长石中钾含量（%）[15]。

研究显示天然钾长石中的钾含量约为12%[16]。

1.3.4 胶冻样芽孢杆菌发酵培养条件优化。

1.3.4.1 碳源筛选及含量优化试验。

不同碳源对不同微生物菌种发酵的影响不同，碳源选择原则是既能快速被菌体吸收利用，又能提高有效活菌数及芽孢率，但微生物工业化发酵生产中，培养基用量大，所以在选用碳源时要使用价格低廉且易于获得的碳源;因蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉相对价格低廉且易制取和获得而被作为首选。该研究以培养胶冻样芽孢杆菌的经典培养基无氮培养基为基础培养基，选取常见碳源蔗糖、淀粉、糖蜜进行碳源单因子筛选及含量优化试验，见表1。