嗜碱纤维素分解细菌的筛选•鉴定及酶活分析

摘要 [目的]从新疆某棉浆废水生化处理系统中分离具有纤维素分解能力的耐碱细菌，分析其物种多样性及纤维素分解酶活性，为生物法处理碱性、纤维素含量高的废水提供菌株。[方法]采用4种特异性碱性培养基分离耐碱细菌，采用刚果红染色法对其中纤维素分解菌进行筛选，通过16S rRNA基因序列分析和生理生化试验对纤维素分解细菌进行初步分类鉴定，采用DNS法对其进行酶活测定。[结果]从各类样品中分离出50株耐碱细菌，筛选出12株纤维素分解细菌，其中有7株芽孢杆菌（Bacillus）、2株涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia）、1株耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans）、1株假单胞菌（Pseudomonas）、1株另类希灭氏菌（Alishewanella），大部分菌株的最适pH为11～12，且具有良好的耐盐性和纤维素分解酶活力。菌株49228和49239分别与Nesterenkonia flava CAAS 251（T）、Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T）的最大相似性为97.71%和98.5%，疑似为潜在的新物种。[结论]该结果初步明确了棉浆废水生化处理系统中的碱性细菌为优势种群，嗜碱纤维素分解菌的获得可为生化法处理纤维素含量高的碱性废水处理提供优势菌株。

关键词 棉浆废水;纤维素分解细菌;筛选;鉴定;嗜碱细菌;酶活分析

中图分类号 Q93  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.004

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening，Identification and Enzymatic Activity Analysis of Alkalophilic Cellulose Decomposing Bacteria

ZHANG Yue-feng1，L Ling-ling1，ZHANG Hai-shen2 et al

（1.College of Agriculture and Food Engineering，Baise University，Baise，Guangxi 533000;2.College of Life Sciences，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300）

Abstract [Objective]To isolate alkali-resistant bacteria with cellulose decomposition ability from some samples of a cotton pulp wastewater biochemical treatment system in Xinjiang，and analyze their species diversity and cellulose decomposition enzyme activities，these strains could be used for biological treatment of wastewater with high alkaline and cellulose content.[Method]Four kinds of specific alkaline media were used to isolate alkali-tolerant bacteria，Congo red staining were used to screen the cellulolytic strains，and 16S rRNA gene sequence analysis and physiological and biochemical experiments would be used to identify taxonomy of cellulose-decomposing bacteria，and the cellulase activity of these strains were determined by DNS method.[Result]Fifty strains of alkali-resistant bacteria were isolated from various samples，and 12 strains of cellulolytic bacteria were screened，including 7 strains of Bacillus，2 strains of Nesterenkonia，1 strain of Brevibacterium halotolerans，1 strain of Pseudomonas，1 strain of Alishewanella，the optimum pH of most strains was 11-12，and had good salt tolerance and cellulolysis enzyme activity.Among them，Similarity of 49228 and 49239 to Nesterenkonia flava CAAS 251（T） and Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T） was 97.71% and 98.5% respectively，they might be potential new species.[Conclusion]The research showed that alkaline bacteria are the dominant species in the treatment system of cotton pulp wastewater，those alkalophilic cellulose-decomposing bacteria can be used as engineering strains for treatment of alkaline wastewater with high concentration of cellulose.

Key words Cotton pulp wastewater;Cellulose decomposing bacteria;Screening;Identification;Alkophilic bacteria;Enzyme analysis

棉浆黑液是以棉短绒为原料生产棉浆粕过程中产生的高污染的废水，其中含有大量的纤维素、木质素、半纤维素等有机污染物，该废水具有碱性高、色度大、难降解的特点[1]，其如何深度处理已成为人们普遍关注的问题之一。目前，对棉浆黑液的处理主要采用生物法或者以生物法为核心的耦合工艺，如生物活性炭纤维法[2]、超声-生物法[3]和生化-物化组合工艺[4]等。在这些工艺中，微生物的种类及代谢活性高低是决定废水处理效率高低的关键因素，基于棉浆黑液具有碱性高、纤维素含量高的重要特点，从某些特定样品中筛选具有分解纤维素活性的高效嗜碱细菌具有重要价值。有研究表明，棉浆黑液中蕴含着大量嗜碱微生物，如文金丽等[5]以棉浆黑液为细菌分离培养基，从某化纤厂黑液生物处理系统中分离到16株嗜碱细菌，经鉴定这些菌株主要为产芽孢的革兰氏阴性细菌。

嗜碱细菌是一类存在于盐碱土壤或水体等环境中，在高pH或高盐条件下能够稳定生长的一类微生物[6-7]。由于长期的环境选择压力使嗜碱细菌演化形成了特殊的生物结构、生理机能和遗传基因，从而对盐碱环境的胁迫表现出良好的适应性，此外，还可以产生多种碱性酶和其他生物活性物质，是研究生物进化、生命起源和生物多样性的重要材料，也是一类极具应用前景的极端环境微生物资源[8-9]，可广泛应用于洗涤剂工业[10]、纺织[11]、造纸[12]、污水处理[13]等领域。因此该研究从棉浆黑液生物处理系统的水样和泥样中分离嗜碱细菌，然后筛选具有代谢纤维素能力的活性菌株，并进行菌种初步鉴定及酶活性测定分析，以期为嗜碱纤维素分解细菌的挖掘以及在碱性难降解废水处理中的应用提供菌株资源和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。采集新疆阿拉尔市某棉浆厂的棉浆黑液、生化池水样和生化池泥样。这3类样品的特点是色度高，含有的主要污染物为纤维素、木质素及其水解产物，其中棉浆黑液的碱性最高（pH约为12.0）、纤维素含量最大，生化池水样和泥样的酸碱性接近中性（pH约为6.5）、纤维素较低。样品采集过程均严格按照无菌操作进行。

1.1.2 嗜碱细菌分离培养基。下列培养基为系列pH不同的培养基。①改良培养基一号：棉浆黑液+15%琼脂，pH 12～13，121 ℃灭菌30 min。②改良培养基二号：生化池水样+15%琼脂，pH 12～13，121 ℃灭菌30 min。③马铃薯-蔗糖培养基：马铃薯200.0 g（切块于1 L水中煮沸15 min，过滤的萃取液），蔗糖20.0 g，琼脂15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。④LB固体培养基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉18.0 g，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。⑤LB液体培养基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 纤维素分解细菌筛选培养基。羧甲基纤维素10.0 g，MgSO4 1.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 0.5 g，酵母粉2.0 g，琼脂 15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。

1.1.4 生理生化试验培养基。酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，琼脂粉18.0 g，定容于1 L容器中，根据培养条件调节不同pH和NaCl浓度，121 ℃灭菌30 min。

1.1.5 主要仪器与设备。LXJ264201型离心机（北京医疗仪器修理厂）;LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）;MycyclerTM Thermod Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）;HYA恒温摇床（中国科学院武汉仪器厂）;SW-CJ-2F 超净工作台（上海博讯实业有限公司）;LGJ-10C型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）。

1.1.6 主要试剂。DNS试剂，采用文献[14]中方法进行配制。CMC缓冲液：称取1.0 g CNC-Na溶于pH=9的缓冲液中（100 mL），沸水浴加热至溶化，冷却，过滤，取滤液50 mL，加pH=7缓冲液10 mL，混匀。刚果红染液：精确称取2.5 g刚果红溶于100 mL烧杯中，定容在250 mL容量瓶。

1.2 方法

1.2.1 嗜碱细菌的筛选分离、纯化及保藏。称取不同的土样10 g，分别放入盛90 mL带有玻璃珠的无菌生理盐水中，在摇床上振荡约3 h。将土壤悬浮液和水样进行梯度稀释，选10-2、10-3和10-4稀释度样品涂布于上述分离培养基平皿，每个平皿接种100 μL，分离培养基pH分别为7、8、9、10、11、12，每个稀释度设3个重复。培养皿于28 °C倒置培养2～5 d后观察菌落生长情况，挑取单菌落至LB固体培养基上纯化。对纯化的细菌进行编号并于30%甘油中-20 °C保藏。

1.2.2 菌株16S rRNA基因测序和序列分析。采用CTAB（cetyltrimethylammonium ammonium bromide）法提取细菌总DNA，16S rRNA基因的PCR扩增和测序引物均为通用保守引物27F和1492R，测序工作由上海生物工程有限责任公司完成。将分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定菌株分类地位。