氨基酸和氨基葡萄糖在离子对LC-MS中保留规律及应用研究

摘要[目的]研究氨基酸和氨基葡萄糖在离子对LC-MS中的保留规律，优化建立壳寡糖等含氨基葡萄糖样本中氨基酸的色谱分析方法。[方法]比较pH、离子对试剂种类、浓度对各氨基酸和氨基葡萄糖保留行为的影响规律，在此基础上，以Lichrospher C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，采用0.5 mmol/L的全氟庚酸（TDFHA）水溶液（pH=2.4）和含0.5 mmol/L TDFHA的乙腈溶液进行梯度洗脱，LC-MS/MS法分离并测定了壳寡糖水解样品中16种氨基酸。[结果]离子对试剂可增加氨基酸、氨基葡萄糖保留，且酸性、碱性氨基酸保留受离子对试剂等影响最为明显，而pH和离子对试剂浓度对氨基葡萄糖的保留影响较小。测得壳寡糖样品中总氨基酸含量为1.03%。[结论]该方法操作简单、分析周期短，为壳寡糖等含氨基葡萄糖的样品中氨基酸分析提供了参考。

关键词壳寡糖;氨基酸;氨基葡萄糖;离子对色谱法;LC-MS;保留规律;含量测定

中图分类号R914文献标识码A

文章编号0517-6611（2022）13-0192-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.13.051

Study on Retention and Application of Amino Acids and Glucosamine in Ion-pair LC-MS

SUN Jie SUN Yue LI Bo

（1.Nanjing Food and Drug Administration， Nanjing， Jiangsu 211198;2.School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing， Jiangsu 210009;3.Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095;4.Institute of Innovative Medicine， China Pharmaceutical University （Hangzhou）， Hangzhou， Zhejiang 310038）

Abstract[Objective] To study the retention rules of amino acids and glucosamine in ion-pair LC-MS， and to optimize the establishment of a chromatographic analysis method for amino acids in glucosamine-containing samples such as chitosan oligosaccharide.[Method] The effects of pH and ion-pair reagent types and concentrations on the retention behavior of amino acids and glucosamine were compared.On this basis， Lichrospher C₁₈ （4.6 mm×150 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column，gradient elution was performed with 0.5 mmol/L perfluoroheptanoic acid （TDFHA） aqueous solution （pH=2.4） and an acetonitrile solution containing 0.5 mmol/L TDFHA.LC-MS/MS method was used to separate and determine the content of 16 amino acids in chitosan oligosaccharide hydrolyzed samples.[Result] Ion-pair reagents can increase the retention of amino acids and glucosamine，and the retention of acidic and alkaline amino acids was most obviously affected by ion-pair reagents， while pH and ion-pair reagent concentrations had little effect on the retention of glucosamine.The total amino acid content in the chitooligosaccharide samples was measured to be 1.03%.[Conclusion] The method is simple in operation and short in analysis period， which provides a reference for amino acid analysis of samples containing glucosamine such as chitosan oligosaccharide.

Key wordsChitosan oligosaccharide; Amino acid;Glucosamine;Ion-pair chromatography;LC-MS;Retention law;Content determination

壳寡糖又叫壳聚寡糖、几丁寡糖、低聚壳聚糖，学名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是壳聚糖经水解得到的一类聚合度在2～20的低聚物，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，其具有水溶性较好、功能作用大、生物活性高、易被人体吸收等特点。目前，壳寡糖已经被应用于食品、医药、农业、日用化工等领域，在人们生活中扮演着越来越重要的作用[1-2]。随着对壳寡糖研究的不断深入，其检测技术方法也不断增多，但目前对于壳寡糖中氨基酸含量测定的相关研究相对较少，所以该研究旨在建立一种测定壳寡糖中总氨基酸含量的方法。

用于氨基酸分析的离子对色谱技术已被广泛使用，发展成熟。离子对色谱法中应用较广的是反相离子对色谱法，它适用于经典反相色谱柱，具有操作简单、分析周期短等优势。其中，离子对试剂是反相离子对色谱法实现上述优点的关键因素。在氨基酸分析中一般在流动相中添加阴离子对试剂改善各氨基酸在经典色谱柱上的分离，例如烷基磺酸盐，常用的有正戊磺酸钠、正己磺酸钠和正庚磺酸钠等[3-4]。未衍生的氨基酸的紫外吸收较弱，常采用质谱作为检测器，因为相比于烷基磺酸盐而言，全氟羧酸具有较低表面能、沸点更低等特点[5-6]，因此更适合质谱（MS）检测器。常用的全氟羧酸有三氟乙酸（TFA）、七氟丁酸（HFBA）、九氟戊酸（NFPA）、全氟庚酸（TDFHA）和全氟辛酸（PDFOA）等[7]。该研究采用离子对色谱法，考察pH、离子对试剂种类和浓度等对氨基酸和氨基葡萄糖色谱保留行为的影响，并在此基础上优化氨基酸和氨基葡萄糖分离条件，建立壳寡糖中氨基酸的离子对LC-MS色谱分析方法。

1材料与方法

1.1试药与试剂氨基酸对照品：丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr），购自BHD Chemicals Ltd.，Poole England，纯度>98.5%;氨基丁酸（内标），购自BHD Chemicals Ltd.，Poole England，纯度>98.5%;氨基葡萄糖对照品，购自国药集团化学试剂有限公司，纯度>99.0%;七氟丁酸，购自Sigma-Aldrich公司，纯度>99.0%;全氟庚酸，购自Sigma-Aldrich公司，纯度>99.0%;水为Milli-Q蒸馏水（去离子水）;乙腈、甲酸、醋酸铵均为色谱纯;其他试剂为分析纯。壳寡糖样品（产地无锡）。

1.2仪器TQS LC-MS/MS联用仪，美国Finnigan公司;Xcalibur1.1工作站，美国Finnigan公司;EL104分析天平，瑞士梅特勒公司;FE20 pH计，瑞士梅特勒公司。

1.3溶液配制

1.3.1氨基酸和氨基葡萄糖对照储备液。分别精密称取16种氨基酸对照品及氨基葡萄糖对照品各10 mg置于100 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl稀释至刻度，配制成浓度为100 μg/mL的氨基酸对照储备液和氨基葡萄糖对照储备液。

1.3.2氨基酸和氨基葡萄糖对照溶液。分别精密移取氨基酸对照储备液和氨基葡萄糖对照储备液各500 μL置于10 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl稀释至刻度，配制成1 μg/mL的氨基酸对照溶液和氨基葡萄糖对照溶液。

1.4试验方法

1.4.1水解样品前处理。精密称取壳寡糖0.25 g于水解管中，按照国际官定分析检测协会（AOAC）方法，用10 mL的6 mol/L HCl溶液混合壳寡糖，真空下封口，在110 ℃ 下水解24 h，冷却后开口，取水解液2 mL，进行减压干燥，将壳寡糖水解残渣置于10 mL容量瓶，用乙醇稀释至刻度，作为水解壳寡糖样品溶液。

1.4.2色谱条件。采用Lichrospher C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，流动相A为0.5 mmol/L 的TDFHA水溶液（pH=2.4）;流动相B为 0.5 mmol/L的 TDFHA乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1。

1.4.3质谱条件。离子化方式为气动辅助电喷雾离子化（ESI）;离子检测方式为正离子，反应离子检测（MRM）;离子化电压5 000 V;雾化室压力137.9 kPa;干燥气温度300 ℃;CID电压5 V，柱后添加0.5%甲酸的甲醇溶液，MRM方式检测。

1.4.4离子对色谱法测定壳寡糖中总氨基酸的含量。分别取氨基酸对照溶液、氨基葡萄糖对照溶液和水解壳寡糖样品各5 μL，注入LC-MS/MS仪，记录图谱，测定各氨基酸峰面积，计算总氨基酸含量。

2结果与分析

2.1质谱条件优化配制10 μg/mL 16种氨基酸对照溶液为样品，流动注射，以15 eV为初始碰撞电压，通过逐个比较子母离子对，得到优化后的质谱条件，见表2。同时柱后添加0.5%甲酸的甲醇溶液，以辅助离子对的解离，提高氨基酸和氨基葡萄糖的质谱响应。

2.2流动相pH的影响首先考察了不添加离子对试剂时，流动相pH对各氨基酸和氨基葡萄糖保留行为的影响。采用pH耐受范围较大的Benetnach C₁₈（2.1 mm×150 mm，5 μm）柱，取氨基酸对照溶液和氨基葡萄糖对照溶液各2 μL，注入LC-MS/MS仪，分别用甲酸和氨水调节水相（10 mmol/L醋酸铵缓冲液）pH至2.5～10.0，并以水相（A）-乙腈（B）95∶5的流动相进行等度洗脱，记录图谱，测定各氨基酸保留时间，见表3。

从表3可以看出，除了芳香族氨基酸及个别分子量较大的氨基酸外，其余氨基酸均在死时间出峰，在C₁₈柱上保留极弱。这主要因为氨基酸在各pH溶液中均呈现离子状态，这也是直接测定氨基酸时普遍存在的问题。

2.3离子对试剂的选择离子对试剂可增强氨基酸在C₁₈柱上的保留，且相比于柱前衍生法，它可以避免衍生反应的副产物、试剂本身干扰等问题，如Waterval等[8]使用含有0.5 mmol/L的TDFHA水溶液和乙腈作为流动相，建立了一种应用于定量分析血浆和尿液中氨基酸的电喷雾电离超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）。该法可以快速、准确地同时测定多种氨基酸，因此，考察了不同全氟取代羧酸离子对试剂对氨基酸和氨基葡萄糖保留行为的影响。