双水相超声法提取野蘑菇三萜类化合物的工艺优化

摘要 [目的]优化野蘑菇三萜类化合物的最佳提取工艺。[方法]以野蘑菇菌种培养所得的菌丝体为原料，采用超声波辅助、异丙醇-硫酸铵双水相体系提取野蘑菇中的三萜类化合物，并建立检测野蘑菇中三萜类化合物的紫外分光光度法（UV法）。对影响三萜类化合物提取率的主要因素——异丙醇体积浓度、硫酸铵质量浓度、提取时间进行单因素试验，在此基础上根据Box-Benhnken试验设计原理利用响应面法对提取工艺进行优化。[结果]野蘑菇菌丝体内三萜类化合物的提取最佳工艺条件为异丙醇体积浓度45%，硫酸铵浓度0.175 g/mL，超声波提取时间35 min（320 W 4 ℃）。在该条件下，三萜提取率为最高。[结论]该研究为野蘑菇中三萜类化合物的提取及进一步开发利用奠定了基础。

关键词 野蘑菇;三萜类化合物;双水相;超声波辅助提取;响应面法

中图分类号 R 284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）14-0145-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.14.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Extraction Optimization of Triterpenoids from  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr. by Ultrasonic-assisted Aqueous Two-phase System

WANG Hao-hao1， WANG Shu-rong2

（1.Jincheng Comprehensive Inspection and Testing Center， Jincheng， Shanxi 048000; 2.College of Food Science and Engineering， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801）

Abstract [Objective]Optimization of the extraction process of triterpenoids from  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr.. [Method]The triterpenoids in  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr. mycelium were extracted by ultrasonic-assisted isopropanol ammonium sulfate aqueous two-phase system， and an ultraviolet spectrophotometry （UV method） was established for the detection of the triterpenoids. Single factor experiments were carried out on the main factors affecting the extraction rate of triterpenoids：isopropanol volume fraction， ammonium sulfate mass concentration and ultrasonic-assisted extraction time. On this basis， the extraction process was optimized by response surface method according to the Box-Benhnken experimental design principle. [Result]The results showed that the optimum extraction conditions of triterpenoids from  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr. Mycelium were as follows： 45% isopropyl alcohol， 0.175 g/mL ammonium sulfate， ultrasonic extraction time of 35 min （320 W 4 ℃）. Under these conditions， the extraction rate of triterpenoids was the highest. [Conclusion]This study can lay a foundation for the extraction and further utilization of triterpenoids from  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr.

Key words  Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr.;Triterpenoid;Aqueous two-phase system;Ultrasonic-assisted extraction;Response surface method

野蘑菇（ Agaricus arvensis  Schaeff ex Fr.），又名田蘑菇，属担子菌纲（Basidiomycetes）伞菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇属（ Agaricus ），多分布于黑龙江、内蒙古、新疆、青海、山西、西藏等地[1-3]。野蘑菇的子实体中到大型，食用起来口感细嫩、味道鲜美，营养价值高。野蘑菇也可药用，有驱除风寒、舒经活络的奇效，是清代名药“舒筋散”中的主要成分。近年来，相关研究发现野蘑菇有抗炎、抗肿瘤、抗衰老、预防三高、保肝护肝及优化血管神经系统等作用[4-6]。这与其中的三萜类化合物、多糖、多肽、多酚类等生物活性成分密切相关[7-12]。

三萜类化合物（triterpenoids）大多是由30个碳原子组成的萜类化合物，少量含有27个碳原子。三萜类化合物又叫灵芝酸，广泛存在于自然界中，有的以游离的形式存在，有的则与糖结合以苷的形式存在，又称三萜皂苷（triterpenoid saponins）。游离的三萜可溶于有机溶剂，难溶于水。目前已从香菇、桦褐孔菌（ Fuscoporia obliqua）、紫芝（Ganodermasinense）、灵 芝（G.lucidum）、茯苓（Poria cocos）、桦褐孔菌（Fuscoporia obliqua）、粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）、红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola） 等多种真菌中分离出三萜类物质[13-16]。三萜类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等生物活性[17-19]。目前常用的提取三萜类化合物的方法有回流

浸提法[20]、超声波提取法[21]、超临界流体萃取法[22]和微波提取法[23-24]等。回流浸提法根据原料中各种成分在溶剂中的溶解程度不同进行回流提取处理，提取程度剧烈，耗时稍长。超临界流体萃取得率较高，但成本也高，微波提取则难以规模化应用。超声波提取技术短时节能，在细胞破碎、药用成分的分离抽提等方面有广泛应用[25]。双水相萃取技术则是通过不同成分在上下两相溶剂中的选择性分布来达到分离的目的，该方法可操作性强，可以最大程度地保持提取物质的活性，在细胞、分子生物等研究领域应用广泛[26]。

笔者建立了一种双水相超声波提取并用UV法快速检测野蘑菇菌丝体中三萜类化合物含量的简便方法，并通过单因素试验及Box-Behnken试验设计对提取条件进行了优化，旨在为野蘑菇的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试野蘑菇菌种（编号：817）由山西农业大学食品科学与工程学院食用菌实验室提供。

白桦脂醇标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他试剂未特殊说明均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法。

将4 ℃保藏的野蘑菇菌种于25 ℃活化一段时间后，接种于PDA试管斜面培养基上。在25 ℃下培养10 d直至培养基上长满菌丝。再将菌种接种并扩大培养在液体培养基中，放入25 ℃恒温摇床中以120 r/min的速率培养11 d即得到野蘑菇菌丝体。取出菌丝体清洗过滤，置于55 ℃烘箱中干燥。烘干后的菌丝体于微型粉碎机中粉碎成粉末，备用。

取上述菌丝体粉末100 mg，加入5 mL双水相溶剂浸提2 h，超声一定时间，离心15 min，取上清液，即为三萜粗提液。

1.2.2 测定方法。

1.2.2.1 标准曲线的制作 。

称取 2.0 mg白桦脂醇标准品，用少量无水乙醇充分溶解，再加乙醇定容至50 mL，得到质量浓度为40 μg/mL的白桦脂醇标准品母液。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的白桦脂醇标准品母液于2 mL离心管中，100 ℃沸水加热蒸干乙醇，依次加入0.2 mL 5%香兰素-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分摇晃，60 ℃金属浴中保温20 min后立即放入冰水中降至室温，随后再加入乙酸乙酯定容至5 mL，充分摇晃，静置5～10 min，得到不同浓度的白桦脂醇标准品溶液。

以空白溶液（不加样品加检测试剂的空白检测液）为参比，将白桦脂醇标准品溶液分别在紫外分光光度计中550 nm处测定吸光值。平行试验3次。以白桦脂醇的质量为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

1.2.2.2 三萜含量的测定。

取三萜粗提液用30%乙醇定容，100 ℃水浴蒸发干粗提液中的有机溶剂，依次加入0.2 mL 5%香兰素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，充分摇晃均匀，在60 ℃金属浴中保温20 min后，放入冰水中降至室温。再加乙酸乙酯定容至5 mL，充分摇晃，静置5～10 min后，4 800 r/min 4 ℃离心10 min，以空白溶液作为参比，在550 nm波长处测定溶液吸光度。按照白桦脂醇质量与吸光值关系公式计算三萜含量，并计算三萜提取率：

三萜提取率（%）= C×V×100/m

式中：C 为提取液中三萜的质量浓度，mg/mL; V 为提取液的定容体积，mL; m 为菌丝体粉末的克数，mg[27]。

1.2.3 单因素试验。

1.2.3.1 异丙醇体积浓度的确定。

分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL异丙醇（体积分数分别为25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%）-硫酸铵（质量浓度为0.225 g/mL）双水相溶剂中浸泡2 h，超声（320 W 4 ℃）提取15 min，4 800 r/min离心10 min。取上清液用30%乙醇定容，通过紫外分光光度法测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳异丙醇体积浓度。

1.2.3.2 硫酸铵质量浓度的确定。

分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL异丙醇（体积分数为40%）-硫酸铵（质量浓度分别为 0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300 g/mL）双水相溶剂中浸泡2 h，超声（320 W 4 ℃）提取 15 min，4 800 r/min离心10 min。取上清液用30%乙醇定容，测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳硫酸铵质量浓度。

1.2.3.3 超声时间的确定。

分别称取100 mg菌丝体粉末样品于离心管中，加入5 mL 40%异丙醇-0.225 g/mL硫酸铵双水相溶剂中浸泡2 h，分别超声（320 W 4 ℃）提取 10、15、20、25、30、35、40 min，4 800 r/min离心10 min，取上清液用乙醇定容，测定三萜含量并计算提取率，以确定最佳超声时间。