通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定花椒中草甘膦及代谢物残留

摘要 [目的]建立一种通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法检测花椒中草甘膦及其代谢物的方法。[方法]样品使用水提取，二氯甲烷液液萃取，采用亲水亲脂固相萃取柱进行通过式净化，净化液在碱性条件下用氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液进行衍生后，使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行分离，以0.1%的甲酸水和乙腈为流动相按比例进行梯度洗脱，采用正离子模式、质谱多重反应监测模式（MRM），利用同位素稀释法绘制标准曲线。[结果]草甘膦及其代谢物在5～500 μg/L呈现良好的线性关系（ R2 >0.99），方法检出限为5.0 μg/kg，方法的回收率为87.4%～97.1%，精密度相对标准偏差（RSD）<10%。[结论]该方法操作流程简便、结果准确可靠，可应用于花椒中草甘膦及其代谢物残留的检验检测。

关键词 花椒;草甘膦;代谢物;残留;通过式固相萃取;超高效液相色谱-串联质谱

中图分类号 TS 264.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）14-0160-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.14.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Glyphosate and Metabolite Residues in Chinese Prickly Ash by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Pass-through Solid Phase Extraction

WANG Zhan-hua，SHI Bei，ZHANG Wen-ping et al

（Zhejiang Institute of Food and Drug Inspection， Hangzhou， Zhejiang 310052）

Abstract [Objective] To establish a method for the detection of glyphosate and its metabolites in Chinese prickly ash by ultra high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry with pass-through solid phase extraction.[Method]The samples were extracted with water and liquid-liquid extraction with dichloromethane，purified by hydrophilic lipophilic solid phase extraction column，and then precolumn-derived with 9-fluorenyl methylchlor under alkaline condition. Separated with ACQUITY UPLC HSS T3 chromatographic column.0.1% formic acid water and acetonitrile were used as mobile phase for gradient elution in proportion. Positive ion mode， mass spectrometry multiple reaction monitoring mode （MRM） were used，and draw standard curve by isotope dilution method.[Result]Glyphosate and its metabolites showed a good linear relationship between 5 and 500 μg/L （ R2 >0.99）.The detection limit of the method was 5.0 μg/kg， the recovery rates of the method were 87.4%-97.1%， and the relative standard deviation （RSD） of the precision was less than 10%.[Conclusion]The method is simple in operation， accurate and reliable in results， and can be applied to the detection method of glyphosate and its metabolite residues in Chinese prickly ash.

Key words Chinese prickly ash;Glyphosate;Metabolite;Residue;Pass-through solid-phase extraction;Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

花椒是我国传统的香辛料，在我国西南地区的菜肴烹饪中占有举足轻重的作用，其衍生产品在医药、农药、防虫等方面具有重要的使用价值[1-2]。近年来随着四川重庆火锅风靡全国，花椒的产销量呈递增趋势，预计到2025年，全国花椒的需求量将接近100万t[3]。花椒种植及相关产业规模逐年扩大，但是对于可以花椒上登记使用的农药品种尚无明确规定，导致花椒产品的农药残留超标的现象时有发生[4]。

草甘膦属于非选择类除草剂，在使用后会发生降解，其主要降解产物是氨甲基膦酸，目前对于草甘膦项目的检验主要检测草甘膦和氨甲基膦酸。随着草甘膦在全球被广泛大量应用，草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸在环境及其生物体中富集，对人类的健康造成很大的威胁，世界卫生组织国际癌症研究机构于2015年3月20日判定，草甘膦具有遗传毒性，它可以损坏DNA，对动物致癌[5]。在日常监测中由于草甘膦及其代谢物本身为强极性，且含膦酸基和氨基酸基两性基团，缺少发色和荧光基团，无法直接使用紫外及荧光检测器进行检测。草甘膦沸点为465.8 ℃，其代谢物氨甲基膦酸沸点为358.0 ℃，无法直接使用气相色谱进行检测。目前用于草甘膦及其代谢物的检测方法主要采用化学衍生的方法，通过降低沸点或增加发色荧光基团来改善GC和HPLC的色谱行为，提高检测响应值[6-8]。

目前我国颁布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中对谷物、油料油脂等7类食品的草甘膦限量作出了具体的规定，限量标准0.05～7.00mg/kg;但是其中调味料中仅对叶类调味料和胡椒作出了限量规定，对花椒没有作出相应的规定[9]。在实际风险监测中参照调味料草甘膦推荐测定方法SN/T 1923和GB/T 23750对花椒中的草甘膦残留量进行监测，由于2种方法均使用了CAX阳离子固相萃取柱进行净化，为传统的吸附-洗脱模式，试验发现，上述2种检测标准中采用净化淋洗液为水相，水相净化液需使用旋转蒸发仪进行浓缩，耗时较长，净化操作过程中需要频繁转移，操作步骤较为烦琐[10-11]。笔者选取花椒为研究基质，利用亲水亲脂固相萃取柱的特点，使用通过式固相萃取技术对目标物的净化，建立通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定花椒中草甘膦及其代谢物（氨基甲酸膦酸）残留的分析方法，以期为日常监督抽检中花椒中草甘膦及其代谢物快速检测提供依据，同时对香辛料中草甘膦及其代谢物残留检测标准制定和更新具有重要的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与耗材

Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司）;SCIEX Triple QuadTM 5500+系统-QTRAPActivated质谱仪（美国ABSciex公司）;Merck Milli-Q超纯水仪（德国默克密理博公司）;SorvallLYNX 6000 超速离心机（美国热电公司）;XPE205分析天平（瑞士梅特勒公司）;MultiReax多通道旋涡混合器（德国Heidolph公司）;Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（美国waters公司）;Waters Oasis HLB （200 mg，6mL） 固相萃取柱（美国沃特世公司）;0.22 μm有机滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 试剂及样品

甲醇（hypergrade for LC-MS，Merck KGaA）;乙腈（hypergrade for LC-MS，Merck KGaA）;丙酮（AR，国药集团化学试剂有限公司）;氯甲酸-9-芴基甲酯（衍生级，纯度≥99.9%，上海安谱科学仪器有限公司）;草甘膦（纯度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）;氨甲基膦酸（纯度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）;1，2-13C215N草甘膦（纯度≥99.8%，TRC Canada）;二氯甲烷（AR，国药集团化学试剂有限公司）;十水合四硼酸钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）;磷酸二氢钾（AR，国药集团化学试剂有限公司）;花椒（采购于杭州联华超市）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制。

1.3.1.1 草甘膦及其代谢物标准储备液的配制。准确称取草甘膦和氨甲基膦酸各10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用纯水溶解后定容至刻度，得到浓度为200 μg/mL的混合标准储备液。

1.3.1.2 草甘膦及其代谢物标准中间液的配制。准确量取草甘膦及其代谢物标准储备液50 μL置于10mL容量瓶中，用纯水至刻度，得到浓度为1mg/L的混合标准中间液。

1.3.1.3 同位素内标储备溶液的配制。准确称取1 mg的1，2-13C215N草甘膦置于10 mL容量瓶中，用纯水定容至10.0mL得浓度为100 μg/mL同位素内标储备溶液。

1.3.1.4 同位素内标工作溶液的配制。取1 mL同位素内标储备溶液于10 mL容量瓶中，用纯水定容至10.0mL得浓度为10 μg/mL同位素内标储备溶液。

1.3.2 样品前处理。

准确称取粉碎后的花椒样品2.0 g于50 mL 塑料离心管中，同时加入100 μL同位素内标储备溶液（浓度为10 μg/mL），静置10 min，加入10mL水，置于MultiReax多通道旋涡混合器上涡旋混合20 min，加入5mL二氯甲烷，涡旋混合10 min，以5 000 r/min离心10 min，取水相于10mL玻璃试管中作为待净化液。取5mL净化液，使用Waters Oasis HLB（200 mg，6 mL）亲水亲脂固相萃取柱进行净化，弃去初始2mL样液，收集洗脱液，待衍生。取1mL样品洗脱液于10 mL具塞玻璃比色管中，加入200 μL 5%硼酸盐缓冲溶液，涡旋混匀。加入200 μL 1.0 g/L 氯甲酸-9-芴基甲酯-丙酮溶液，涡旋混匀。在20 ℃下放置4 h，进行衍生化反应。衍生化溶液使用0.22 μm有机滤膜过滤后进行液相色谱串联质谱测定。

1.3.3 标准曲线溶液的制备。分别量取草甘膦及其代谢物混合标准中间液（1mg/L）50、100、500、1 000、2 000、5 000 μL，置于10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，作为混合标准工作溶液，浓度分别为5、10、50、100、200、500 μg/L。移取标准工作溶液各1.0mL加入同位素内标工作溶液（100 μg/mL）10 μL，按样品衍生化方法进行衍生化处理，用0.22 μm有机滤膜过滤，进行液相色谱串联质谱测定。