鲢鱼感染嗜水气单胞菌FAH5后免疫因子的变化研究

摘要  为研究鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后机体免疫因子的变化过程，在健康鲢鱼体内注射嗜水气单胞菌FAH5，感染后12～108 h收集鲢鱼的血液和肝脏，使用分光光度计测定血液铁浓度和载体蛋白浓度，使用ICP-AES测定肝脏铁浓度，使用实时荧光定量PCR测定铁调素基因hepc20、白细胞介素基因il-1、酪氨酸激酶基因jak1、应激因子基因stat1的表达量。结果表明，健康鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染不同时间后，鲢鱼血液铁浓度出现不同程度的降低，其中24和36 h时与对照组比较，达到显著差异;血液载铁蛋白浓度与对照组比较，出现不同程度上升，但均未达到显著差异;肝脏铁浓度与对照组比较，出现不同程度上升，但均未达到显著差异。肝脏中hepc20铁调素基因的表达量在12和24 h时与对照组比较上升，达到显著差异;肝脏中il-1白细胞介素基因的表达量在24和36 h时与对照组比较上升，达到显著差异;肝脏中酪氨酸激酶jak1基因的表达量在12和24 h时与对照组比较上升，达到显著差异;肝脏中stat1应激因子基因的表达量在12和24 h时与对照组比较上升，达到显著差异。因此，鲢鱼机体通过调节铁调素基因hepc20、白细胞介素基因il-1、酪氨酸激酶基因jak1、应激因子基因stat1等免疫基因的表达的变化，降低机体游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对嗜水气单胞菌FAH5的感染。

关键词  鲢鱼;嗜水气单胞菌FAH5;免疫因子;基因表达

中图分类号  S 917.4   文献标识码  A    文章编号  0517-6611（2022）15-0083-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.15.022

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Study on Changes of Immune Factors in Silver carp Infected with Aeromonas hydrophila FAH5

YU Wen-jie， XIE Jian-hua

（College of Food Engineering， Zhangzhou Vocational and Technical College， Zhangzhou，Fujian 363000）

Abstract  In order to study the change process of immune factors of Silver carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5， after injecting Aeromonas hydrophila FAH5 into healthy Silver carp， the blood and liver of Silver carp were collected 12-108 h after infection， the blood iron concentration and blood ferritin concentration were measured by spectrophotometer， and the liver iron concentration was measured by ICP-AES. The expressions of hepc20， il-1， jak1 and stat1 were measured by real-time fluorescence quantitative PCR. After healthy Silver carp were infected with Aeromonas hydrophila FAH5 for different times， the blood iron concentration of Silver carp decreased in varying degrees， and there was significant difference compared with the control group at 24 and 36 hours.Compared with the control group， the blood ferritin concentration increased in varying degrees， but there was no significant difference.Compared with the control group， liver iron concentration increased in varying degrees， but there was no significant difference. The expression of hepc20 ferritin gene in liver increased significantly compared with the control group at 12 and 24 hours.The expression of il-1 interleukin gene in liver increased significantly compared with the control group at 24 and 36 hours;the expression of tyrosine kinase jak1 gene in liver increased significantly compared with the control group at 12 and 24 hours;the expression of stat1 stress factor gene in liver increased significantly compared with the control group at 12 and 24 hours. Therefore， the Silver carp body responds to the infection of Aeromonas hydrophila FAH5 by regulating the expression of immune genes such as hepc20， il-1， jak1 and stat1， reducing the free iron concentration and increasing the stored iron concentration.

Key words  Silver carp;Aeromonas hydrophila FAH5;Immune factor;Gene expression

鲢鱼属于鲤形目的鲤科，体侧扁平，腹部大。鲢鱼肉质柔软细腻，富含蛋白质、维生素、矿物质和氨基酸，对人体营养价值较高，特别适合小孩、孕妇食用。鲢鱼作为滤食性淡水生物，食用浮游生物和硅藻及其衍生物、动植物碎屑等。目前福建省漳州地区和漳浦地区形成了较大规模的养殖基地和养殖场。但是养殖场为了获得较大的经济效益，采用高密度养殖和高蛋白饵料投食，使得鲢鱼的水生环境恶化，引起鲢鱼传染性疾病经常暴发，养殖场为了防治这些传染性疾病耗费了大量的人力物力和财力。实验室前期研究发现，这些传染病的源头主要是嗜水气单胞菌FAH5的感染[1]。嗜水气单胞菌是隶属于气单胞菌科和气单胞菌属的革兰阴性菌，存在于水体环境中。嗜水气单胞菌会使得水生生物产生气单胞菌败血症和溶血病。嗜水气单胞菌体内存在的溶血素和气溶素会引发寄主细胞破裂，细胞内容物分散出来，最终导致其死亡。鲢鱼血液铁元素可以和蛋白质合成载铁血红蛋白，主要功能是输送氧气和二氧化碳[2]。同样鲢鱼体内铁元素参与免疫系统发挥积极有效作用，可以增加巨噬细胞的杀菌作用。但是铁元素也是病原体的生长元素，使得病原体生长迅速。所以，水产动物鲢鱼可以通过调节铁元素相关基因的表达过程来控制血液铁浓度和载铁蛋白浓度，从而抑制和拮抗外来病原体的生长。铁调素蛋白可以由hepc20基因表达得到，在鲢鱼肝细胞产生，具有很强的抑菌活性。铁调素蛋白的含量高低与鲢鱼体内的铁元素浓度有密切关系[3]。白细胞介素il-1由il-1基因编码，可以调节免疫细胞，有助于激活蛋白酪氨酸激酶和应激因子信号通路，可以增加铁调素基因表达，促进铁调素成熟和发挥生物学功能，达到机体免疫的基本目的[4]。该研究通过检测健康鲢鱼感染嗜水气单胞菌FAH5后，分析鲢鱼机体血液铁浓度、血液载铁蛋白浓度和肝脏铁浓度的变化，以及鲢鱼肝脏中hepc20、il-1、jak1和stat1基因表达变化情况，从而探讨溶血性嗜水气单胞菌FAH5感染鲢鱼对免疫因子的变化情况，获得水生生物鲢鱼铁元素相关基因和铁元素浓度在感染嗜水气单胞菌FAH5过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 健康鲢鱼的获取

健康鲢鱼从福建省淡水水产研究所鲢鱼养殖基地购买得到，健康鲢鱼幼体外表光亮、整洁、活动灵活、反应灵敏。获得的幼鱼重量是（80±10）g，长度是（18±2）cm。按照试验目的将健康鲢鱼随机分成试验组和对照组，每组设定3个平行，每个平行有50尾鲢鱼，总共300尾。

1.2 嗜水气单胞菌FAH5感染样品的收集

将前期分离得到的感染活性嗜水气单胞菌FAH5采用琼脂富集培养基进行培养，30 ℃培养24 h。培养至对数期后，使用0.65%无菌生理盐水将培养菌稀释成5.0×105 CFU/mL，然后使用一次性注射针吸取0.1 mL菌体腹腔注射试验组鲢鱼[5]。对照组鲢鱼腹腔注射0.1 mL 0.65%无菌生理盐水。试验处理后12、24、36、48、60、72、84、96和108 h作为试验点，收集每个平行中的3尾鲢鱼。收集得到鲢鱼尾部静脉血0.5～0.6 mL，血液中加肝素钠防止凝集，并保存在4 ℃冰箱备用。抽血完成后鲢鱼超净工作台中解剖，得到肝脏保存在-80 ℃冰箱中备用。

1.3 血液铁浓度和载铁蛋白浓度的测定

血液铁浓度和载铁蛋白浓度的测定是采用供应商的血液铁浓度和载铁蛋白浓度检测试剂盒（上海瑞楚生物科技有限公司）进行。该试验使用紫外分光光度计（UV-1800，上海清华科学仪器有限公司）对样本进行重复测定3次，取其平均值作为试验结果。

1.4 肝脏铁浓度的测定

该试验采用干法消化的技术测定肝脏铁元素浓度[6]。鲢鱼肝脏解冻后，采用无菌生理盐水清洗3次，采用滤纸吸干表面水分，并称重，然后放入坩埚中，使用马弗炉600 ℃灼烧约5 h，直到样品呈现白色或灰白色。最后自然冷却至室温，灼烧后样品再加入1 ∶1的硝酸水溶液5 mL，电炉消化至沸腾，滤纸过滤消化液后移入容量瓶，使用双蒸水多次冲洗坩埚，滤纸过滤后移入容量瓶，使用双蒸水定容至50 mL。使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-1200，北京吉田仪器有限公司）对样本重复测定3次，取其平均值作为试验结果。

1.5 鲢鱼肝脏铁元素相关基因表达的变化

通过NCBI数据库设计鲢鱼hepc20基因cDNA序列[7]、il-1基因cDNA序列[8]、jak1基因cDNA序列和stat1基因cDNA序列引物[9]，具体引物序列见表1。而后采用RNAiso plus total RNA提取试剂盒（宝生物工程大连有限公司）获取鲢鱼肝脏总RNA，反转录制备cDNA，使用实时荧光定量仪（RTQ-960 pro，艾康生物技术杭州有限公司）对这4种基因进行分析。这4种基因的相对表达量使用鲢鱼18S rRNA基因表达量为对照。QR-PCR扩增反应溶液：10倍PCR缓冲液5.0 μL、dNTP混合液3.0 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、cDNA模板2.0 μL、Taq酶0.5 μL，ddH2O补足终体积30.0 μL。QR-PCR扩增条件：预变性93 ℃，3 min;90 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环;最后72 ℃延伸10 min。每个样本进行重复性试验平行检测3次。

1.6 统计学方法

所有获得的数据使用SPSS 18.0软件进行分析，采用t检验分析差异显著性[10]。所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析