毛细管多重电泳技术鉴定水稻种子纯度研究

摘要  [目的]建立一种混合多个PCR产物的高效单色毛细管电泳技术。[方法]以杂交水稻丰两优3305和常规稻润稻118为试验材料，结合品种指纹数据和PCR产物片段大小之间的差异，筛选出适用于该品种纯度鉴定的SSR分子标记。通过单重和多重毛细管电泳结果比对，验证多重电泳技术应用于SSR分子标记检测水稻纯度的实用性。[结果]片段差异10 bp及以上不同分子标记的PCR产物可以进行多重电泳。多重毛细管电泳技术既能降低检测成本，又能提高试验效率，可进一步提升毛细管电泳仪使用效能。[结论]该研究可为高效检测水稻种子纯度提供技术参考。

关键词  水稻;SSR分子标记;纯度鉴定;多重电泳

中图分类号  S 511   文献标识码  A    文章编号  0517-6611（2022）15-0090-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.15.024

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Preliminary Study on the Identification of Rice Seed Purity by Multiple Capillary Electrophoresis

FAN Jia-meng， WANG Zhi-yan， LIN Hui-hui et al

（Hefei Fengle Seed Industry Co.， Ltd.，  Key Laboratory of Anhui Province for New Techniques and Varieties of Crop Seeds， Hefei， Anhui 230088）

Abstract  [Objective]To establish a high-efficiency single-color capillary electrophoresis technology for  mixing multiple PCR products.[Method]The hybrid rice Fengliangyou 3305 and the conventional rice Rundao 118 were used as experimental materials， based on the difference between cultivar fingerprint data and PCR product fragment size， to screen the SSR molecular markers suitable for the purity identification of this variety. Comparison of singleplex and multiplex capillary electrophoresis results， to verify the practicability of multiplex electrophoresis technology applied to SSR molecular markers to detect the purity of rice. [Result]The results showed that PCR products with different molecular markers with a fragment difference of 10 bp or more can be multiplex electrophoresed. Multiple capillary electrophoresis technology can not only reduce the detection cost but also improve the experimental efficiency， it can further improve the performance of the capillary electrophoresis instrument. [Conclusion]The study can provide a technical reference for the efficient detection of rice seed purity.

Key words  Rice;SSR molecular marker;Purity identification;Multiple electrophoresis

品种纯度是衡量种子质量的重要指标，品种纯度鉴定包括田间鉴定和室内鉴定2种方法[1]。田间鉴定是在作物生育期间，结合检查病虫杂草以及田间生育状况和倒伏情况对田间进行品种纯度检验，耗时费力。室内纯度鉴定目前主要是SSR分子标记鉴定。SSR分子标记技术是一种基于扩增PCR和微卫星定位的DNA特性的标记技术，微卫星DNA的长度呈现高度变异，但是其两侧的碱基序列高度保守，因此可以根据保守序列，设计引物对DNA进行PCR扩增，通过扩增产物的长度多态性，揭示不同的个体或品种间的遗传差异[2]。该技术一直以高效、准确可靠、不受环境影响等优势而得到广泛应用。

分子标记鉴定的效率和成本主要取决于PCR产物电泳所用仪器及电泳方法[3]。目前分子标记鉴定技术中电泳分析环节包括3种途径：①聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）;②ZAG单色毛细管电泳仪电泳;③DNA分析仪的荧光电泳。其中PAGE操作复杂、分辨率不高、效率低;在试验操作过程中会有试剂污染，对实验员及实验室安全卫生都有不同程度的影响。DNA分析仪的荧光电泳由于仪器和试剂价格昂贵，运行成本高，在商业化应用中受到极大限制[4]。

ZAG单色毛细管电泳仪以进样量少、分析速度快、分离效率高、有机溶剂少、自动化程度高等特点被广泛应用于分子生物学、医药学、高分子等领域，但由于是单色荧光显色，试剂耗材依靠厂家提供，造成单重电泳的使用成本偏高[5]。笔者拟采用混合不同片段大小的PCR产物进行多重电泳，以提高试剂耗材的利用率，进一步提升ZAG单色毛细管电泳仪的使用效能[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1    试验品种。

随机选用合肥丰乐种业股份有限公司2021年生产的杂交水稻品种丰两优3305与常规稻品种润稻118。

1.1.2    试剂来源。

PCR反应所用Buffer、DNTP等试剂购于上海生工生物工程有限公司，引物合成于安徽通用生物科技有限公司，Taq酶购于艾科瑞生物科技有限公司，试验耗材购于合肥舜田实验部。

1.1.3    主要仪器设备。

T100型梯度PCR仪，美国伯乐（Bio-Rad Laboratories，Inc.）公司;Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪，美国热电公司;ZAG-Z7576毛细管电泳仪，Agilent公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1    DNA快速提取及质量检测。

每个品种随机取96株幼苗，每株幼苗取0.8 cm×0.8 cm大小的样品，放入PCR板中，加入0.25 mol/L NaOH溶液20 μL，放进水浴锅中99 ℃煮2 min，然后加入0.25 mol/L Tris-HCl溶液30 μL后冷却。用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度和质量，DNA浓度在15～50 ng/μL，DNA质量A260/A280在1.8～2.0。

1.2.2    PCR反应体系及扩增程序。

PCR反应体系（10 μL）：

DNA模板2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 4.5 μL，PCR Master Mix 2.5 μL。

PCR扩增反应程序：94 ℃预变性4 min;然后每个循环变性：94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s。循环次数32次，72 ℃保温10 min。

1.2.3    SSR分子标记引物选择。

根据GB/T 39917—2021《主要农作物真实性和纯度SSR分子标记检测 稻》中推荐的8对候选引物[7]，参照丰两优3305的指纹图谱，找到丰两优3305双亲带型有差异的引物，分别是RM336、RM208、RM224、RM8277、RM19，在RM19标记位点上的指纹是245/251，父母本差异偏小，排除该标记位点，用RM224、RM8277、RM336、RM208进行纯度鉴定并组合双重电泳。根据润稻118品种的SSR分子标记上的带型，选择多态性较好且产物片段大小差异较大的3个引物RM224、RM8277、RM19进行SSR分子标记纯度鉴定（表1）。

1.2.4    毛细管电泳。

1.2.4.1    普通单重毛细管电泳。

将96孔PCR产物加buffer定容至25 μL，打开ZAG软件后，选择样品托盘Sample tray→ 添加托盘Add tray to queue → 选择跑胶模式（1板费胶模式+8板省胶模式）→ 点击Edit更改电泳参数，一般设置电压4～5 kV，室温高于25 ℃时，每板电泳时间在50 min左右，温度越低，电泳时间越长。更改参数后之后点击OK，在待电泳界面点击绿色运行标识即可进行电泳。

1.2.4.2    多重毛细管电泳。

扩增产物采用单色ZAG-Z7576毛细管电泳仪。将2～3个不同引物的PCR扩增产物混合，每个扩增产物取5 μL至新的96孔PCR扩增板，然后加双蒸水定容至25 μL。软件及仪器操作步骤与单重毛细管电泳一致。

1.2.5    纯度统计。

样品纯度=（供检株数-杂株数）/供检株数×100%

2 结果与分析

2.1 杂交种纯度检测单重电泳结果

丰两优3305在RM224标记位点上的纯度检测结果见图1，1 bp和500 bp处是试剂盒Marker的范围，即PCR产物片段在1～500 bp。丰两优3305在RM224标记位点的片段是159（母本带）/185（父本带）（表1）。H2孔没有扩增产物，记为空，供检株数94株，A8孔的带型是母本带159和非父本带196;H6孔是仅一条母本带159，H12孔是标尺（图1）。

丰两优3305在RM8277标记位点上的纯度检测结果见图2，Marker与图1一致。该产物片段是220（父本带）/234（母本带）（表1）。A8和H2孔没有产物，记为空，H12孔是标尺。供检株数93株，所有单株的PCR产物带型一致，没有杂带（图2）。

丰两优3305在RM336标记位点上的纯度检测结果见图3，产物片段是133（父本带）/159（母本带）（表1）。其中，A2、G1、G2、H4、H5共5个孔没有扩增产物，记为空，供检株数91株，A4和H1孔都是1条母本带159，其他孔带型一致。