糯米山药炭疽病病原菌的分离•鉴定与生物防治

摘要 从糯米山药病叶分离病原菌，通过形态学和rDNA-ITS序列对病原菌进行鉴定，结合柯赫氏法则验证其致病性，并研究2株哈茨木霉菌对病原菌的生物防治效果。结果表明，3株分离菌株WC01、WC02和WC03的形态特征及ITS序列与炭疽病菌属（Colletotrichum spp.）相符，且3株菌株对糯米山药均有致病性。3株菌株在pH 4～11条件下均能生长，其中最适pH为5～9;菌丝最适生长温度皆为30 ℃，超过30 ℃即不再生长。平板对峙试验结果表明哈茨木霉菌株Th7和Th19对于3株病原菌都有明显的抑制效果，同时通过施用哈茨木霉Th7能有效降低糯米山药炭疽病病情指数，总体田间病害防治效果为49.72%。该研究为糯米山药的炭疽病防控提供了一套绿色防治方案与理论依据。

关键词 山药;炭疽病;菌株生长特性;木霉;生物防治

中图分类号 S 432.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）16-0094-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.16.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation，Identification and Bio-control of the Anthracnose in Glutinous Yam

ZHANG  Cheng-nian1，HUANG  Zhe-hong2，WANG  Ke-jing3 et al

（1.Wencheng Modern Agriculture and Health Industry Research Institute，Wenzhou，Zhejiang 325000;2.Sanming Academy of Agricultural Sciences，Sanming，Fujian 365050;3.Moon （Guangzhou） Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong  510700）

Abstract In this study，the pathogens were isolated from the diseased leaves of glutinous yam.The isolated pathogens were identified by morphological and rDNA-ITS analysis，and their pathogenicity was verified by Koch’s rule.The control effects of two Trichoderma harzianum strains on the isolated pathogens were assayed.The morphological observation and rDNA-ITS sequence of the three pathogens were consistent with those of the genus Colletotrichum spp，and the pathogenicity assay showed that three isolated strains were pathogenic to the leaves of glutinous yam.All strains could grow under the condition from pH 4 to 11，and the optimum growth region was from pH 5 to 9.The optimum growth temperature of the three strains was 30 ℃，whereas none of them could grow above 30 ℃.Antagonistic analysis of T.harzianum showed that both T.harzianum Th7 and Th19 had inhibitory function against three Colletotrichum spp.The inhibition efficiency of Th7 was 100%.Application of Th7 could effectively reduce the disease index of yam anthracnose in the field，and the control effect of Th7 reached up to 49.72%.Collectively，this study confers an eco-friendly strategy to control the Colletotrichum-induced anthracnose of glutinous yam.

Key words Yam;Anthracnose;Growth characteristic of strain;Trichoderma;Bio-control

山药 （Dioscorea alata L.），别名薯蓣、参薯、大薯、田薯等，属于薯蓣科 （Dioscoreaceae） 薯蓣属 （Dioscorea）一年或多年生缠绕性藤本植物，其利用部位为根状或块状茎，山药除食用功能外还有补脾、养肺、固肾等保健功效[1]。我国山药种植面积常年稳定在33.33万hm2左右，分布区域遍布全国，许多地方的山药品种已形成区域品牌，如河南温县铁棍山药、湖北武穴佛手山药、江西瑞昌山药、福建清流雪薯、福建山格淮山、浙江文成糯米山药等。文成糯米山药以其糯性为主要特色，全县近年种植面积为400.00～533.33 hm2，平均产量30 t/hm2，市场销售价达16元/ kg，产值高达48万/hm2，成为文成县农业特色产业，也被文成县作为乡村振兴的有力助手。但文成糯米山药抗病能力弱，炭疽病的发生尤其严重，一般造成减产20%～30%，严重时达50%以上，甚至绝收[2]。炭疽病是山药的主要病害，各地山药炭疽病的病原菌存在差异，林永康[3]从福建沙县山药病叶分离的致病菌为辣椒炭疽菌 （Colletotrichum capsici） ，黄婷[4]从江西瑞昌山药的

病叶中分离出胶孢炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides），韩晓勇等[5]从江苏六合山药病叶中分离到胶孢炭疽菌与暹逻炭疽菌 （Colletotrichum siamense）。目前文成糯米山药炭疽病的相关研究仍未见报道，因此分离鉴定糯米山药病原菌是精准防控其炭疽病的首要课题。目前山药炭疽病防治以化学防治为主，在生产上常用防治药剂有70% 甲基硫菌灵、50% 烯酰吗啉、30%苯醚甲环唑乳油、50%氯溴异氰尿酸、75%拿敌稳等，然而化学农药的频繁施用不仅造成食品安全问题而且破坏土壤生态。生物防治具有绿色、生态、高效、安全等特点。Palaniyandi等[6]用具有生防能力的链霉菌防治山药病害取得良好效果;李华[7]用地衣芽孢杆菌防治辣椒炭疽病，防治效果可达68.1%;冯江鹏等[8]用贝莱斯芽孢杆菌防治草莓胶孢炭疽病，预防效果达95%以上。哈茨木霉菌已被应用于多种植物病害的生物防治，Brito等[9]研究表明木霉对芒果青枯病具有良好的防治效果;Swehla等[10]研究表明，哈茨木霉的分离物对菜豆根腐病病原菌具有抑制作用;Li等[11]研究发现大白菜接种哈茨木霉后，可降低大白菜马蹄根病的发生率。宋光桃[12]从油茶根际土壤中分离出3株木霉菌，其对油茶炭疽病抑菌效果较明显。笔者分离了糯米山药的炭疽病原菌，通过形态学和rDNA-ITS序列对病原菌进行鉴定，同时探究其生长适应条件，验证可用于糯米山药炭疽病生物防治的哈茨木霉菌生防菌剂，并开展田间药效试验，探明糯米山药炭疽病病原菌的菌属、生存条件以及挑选抑制炭疽病发生的生物防治，以期为文成糯米山药的绿色生物防治提供有效措施和理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年7月从浙江文成县沙垟采集糯米山药呈典型炭疽病病状的病叶样品，样品采集后立刻进行病原菌分离。

1.2 病原菌分离及纯化 通过常规分离法分离病菌，将PDA平板置于28 ℃培养箱中进行培养。待菌落长成，挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化，并在显微镜下观察其孢子形态。

1.3 病原菌形态学鉴定

将分离纯化的病原菌接种至PDA平板培养基，3 d后观察菌丝形态特征，并镜检分生孢子形态，参考东秀珠等[13]的方法。

1.4 病原菌分子鉴定

采用 CTAB 法[14]提取病原菌DNA，采用真核生物通用引物扩增rDNA-ITS序列 （ITS5：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[15]。PCR反应在50 μL体系中进行，依次加入以下试剂：ITS5（10 μmol/L） 0.5 μL，ITS4（10 μmol/L） 0.5 μL，DNA 模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，ddH 2O 23.0 μL，混匀后按如下程序进行 PCR 扩增：95 ℃预变性10 min，5 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环， 最后一次循环后，72 ℃ 10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，回收产物交由铂尚公司进行测序，获得的序列上传到 NCBI Genbank 数据库，同时进行序列同源性分析。

1.5 致病性鉴定

将供试菌株接种到PDA平板上培养7 d后，用无菌水冲洗分生孢子，用血球计数板配制1×106 个/mL孢子悬浮液。采未转绿的新鲜山药嫩叶，用灭菌水将叶片表面冲洗干净，晾干之后，用75%乙醇擦拭，待叶片表面残留的水干之后，吸取5 μL孢子液，滴加于叶片上，放置于水琼脂培养皿保湿并在室温下等待其发病。

1.6 病原菌生长条件

探究温度及pH对分离菌株生长的影响，测定方法：将分离菌接种于pH为5.7的PDA培养基，并放置于25、30、35、40、45 ℃下，6 d后观察并记录菌落直径。配制PDA培养基pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12，接种菌株放置温度为30 ℃的培养箱在第6天进行观察，并记录菌落的直径。

1.7 哈茨木霉菌与炭疽病菌平板拮抗试验

采用平板对峙法[16]，选取哈茨木霉菌株Th7和Th19（慕恩（广州）生物科技有限公司提供）对所分离的炭疽菌进行拮抗试验。分别记录拮抗3和9 d的菌落直径，并计算抑制率[17]。

1.8 哈茨木霉Th7对炭疽病的田间防治试验

2020年设置长9 m、宽1 m的糯米山药，3个重复，以喷施水处理作为CK，对株高50 cm的山药幼苗叶片喷哈茨木霉Th7（样品由慕恩（广州）生物科技有限公司提供）300倍稀释液，叶片正反两面喷施至叶面滴水，间隔15 d喷施一次，于2020年6月15日和8月15日按5点取样法对文成糯米山药进行病害调查，记载病情指数和计算防治效果。病害分级标准[18]：0级，无病斑;1级，叶面的病斑面积占整个叶面积5%以下;2级，叶面的病斑面积占整个叶面积6%～10%;3级，叶面的病斑面积占整个叶面积11%～25%;4级，叶面的病斑面积占整个叶面积26%～50%;5级，叶面的病斑面积占整个叶面积50%以上。计算公式：

病情指数=（病叶×相对级数）调查总叶数×最高级数×100

防治效果=对照病情指数-处理病情指数对照病情指数×100%

1.9 数据处理与统计分析 用SPSS 23.0进行方差分析与student t-test检验，用Excel 2016处理数据和绘图，通过MEGA 7构建系统发育树[19]。

2 结果与分析

2.1 糯米山药病原真菌的分离

图1为采集的文成沙垟村与二源村种植的糯米山药病叶，病斑的中心为褐色向外圈扩展至灰黑色，呈同心圆，是典型的炭疽病病叶的病斑特征。