超高效液相色谱法测定贻贝中苯和二甲苯的代谢物

摘要 [目的]建立二极管阵列检测器-超高效液相色谱（PDA-UPLC）法检测贻贝中苯和二甲苯代谢物的方法。[方法]贻贝样品经盐酸水解，乙酸乙酯提取，正己烷净化，以15 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相，检测波长为235 nm，流速0.2 mL/min，Waters ACQUITY UPLC BEH C 18柱分离，外标法定量。[结果]苯和二甲苯代谢物在各自线性范围内呈良好的线性关系（ R 2>0.99），方法检出限为10.0～25.0 μg/kg，定量限为20.0～50.0 μg/kg，平均回收率在83.40%～113.10%，相对标准偏差（RSD）不大于8.62%。[结论]该方法具有操作简单、准确定性和灵敏度较高的特点，适合贻贝中苯和二甲苯代谢物残留量的测定。

关键词 超高效液相色谱法;苯;二甲苯;贻贝;代谢物

中图分类号 TS 254.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）17-0172-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.17.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of the Metabolites of Benzene and Xylene in Mussel by Ultra Performance Liquid Chromatography

HU Fen-jing1， PENG Hong-hui2， LIAO Si-yang3 et al

（1.Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau Integrated Technical Service Center， Zhoushan，Zhejiang 316000;2. Zhoushan Fulaiju Food Co.， Ltd.， Zhoushan，Zhejiang 316000;3. Hangzhou Customs District of the People’s Republic of China，Hangzhou，Zhejiang 310007）

Abstract [Objective]To establish a method for the detection of benzene and xylene metabolites in mussels by photodiode array detector-ultra performance liquid chromatography （PDA-UPLC）.[Method] Mussel samples were hydrolyzed by hydrochloric acid， extracted with ethyl acetate， purified with  n -hexane， then identification and quantification of the concentrate was carried out under the wavelength of 235 nm with the mobile phase consisted of 15 mmol/L ammonium acetate water-methanol at the flow rate of 0.2 mL/min and separated on a Waters ACQUITY UPLC BEH C 18 column using external standard method. [Result]Benzene and xylene metabolites showed a good linear relationship within their respective linear ranges （ R 2>0.99）.The detection limit of the method was 10.0 - 25.0 μg/kg，the quantification limit was 20.0-50.0 μg/kg， the average recovery was 83.40%-113.10%， and the relative standard deviation （RSD） was not more than 8.62%.[Conclusion]The method has the characteristics of simple operation， accurate quality and high sensitivity， and is suitable for the determination of benzene and xylene metabolite residues in mussels.

Key words Ultra performance liquid chromatography（UPLC）;Benzene;Xylene;Mussels;Metabolites

苯系物作为有机溶剂和稀释剂的主要成分，已被广泛应用于单独和混合物中其他化学品的合成。已有的研究表明，苯系物多存在于海水和沉积物中，由于其生物降解时间长，对海洋生态系统造成长期和较大的危害[1-4]。紫贻贝因营养丰富、肉质鲜美且繁殖速度很快，目前已经成为主要海水养殖经济贝类之一[5]。贻贝是典型的滤食性双壳贝类，代谢率较低，被广泛用于全球海洋污染的生物监测中[6-7]。N-Acetyl-S-（phenyl）-l-cysteine（PMA）因其半衰期较长，和反，反-粘康酸（ trans，trans -Muconic acid，MU）均为有效和敏感的苯代谢标志物[8-10]。二甲苯3种同分异构体在人体内被氧化成 o-、m-和p- 甲苯酸，然后与甘氨酸结合，以 o-、m-和p- 甲基硫尿酸的形式在尿液中排泄[11]。甲基硫尿酸作为生物标记物研究二甲苯与暴露水平的相关性[12-13]。

苯和二甲苯代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[14-16]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[17-19]、高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱联用（HPLC-TOF/MS）[11]等，但研究对象大多是尿液、土壤[20]、牙齿[21]等基质，前处理方法有直接离心处理、液液萃取和固相萃取等方法。但是目前鲜见贻贝样品中苯和二甲苯代谢物的研究报道，该研究贻贝样品采取盐酸酸化、乙酸乙酯提取、氯化钠防止乳化、正己烷脱脂等前处理方法，结合超高效液相色谱技术，建立适合贻贝中苯和二甲苯代谢物的二级管阵列检测器-超高效液相色谱（PAD-UPHC）检测方法，并应用于东海沿岸贻贝中苯和二甲苯代谢物的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试材

SHIMADZU Nexera X2 Lc-30A液相色谱仪配二极管检测器（日本SHIMADZU公司）;XS105 分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;ST-16R 型高速冷冻离心机（美国Thermo 公司）;氮吹仪（美国Organomation公司）;乙腈、甲醇、甲酸、正己烷（色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司）;2-甲基马尿酸（2-MHA）、3-甲基马尿酸（3-MHA）、 4-甲基马尿酸（4-MHA）、N-Acetyl-S-（phenyl）-l-cysteine（PMA）、反，反-粘康酸（MU）标准品（美国Sigma Chemicals;St.Louis，MO.）;盐酸、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 样品前处理

取5.0 g样品于50 mL离心管，加10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液和2.0 g氯化钠，用均质器以1 000 r/min均质1 min，20 mL乙酸乙酯提取，超声5 min，漩涡混合30 s后，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，收集乙酸乙酯层，残留物再用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯。收集液在40 ℃下旋转蒸发浓缩近干，残渣用1.0 mL流动相溶解，再用3.0 mL乙腈饱和的正己烷脱脂2次，下层液体过0.22 μm微孔滤膜后，待测。

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C 18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），进样盘温度4 ℃，柱温40 ℃，进样量2.0 μL。流动相A相为15 mmol/L 乙酸铵，B相为甲醇;流速0.2 mL/min，检测波长为235 nm，流动相梯度洗脱如表1所示。

1.4 测定方法

在空白贻贝中加入系列浓度的苯和二甲苯代谢物混合标准溶液，混匀后按“1.2”和“1.3”进行样品前处理和检测，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

苯和二甲苯代谢物属于含有羧基的有机酸类物质，为获得较高的重现性和分离效果，流动相中加入一定的酸可以抑制羧基解离，该研究选取0.1%乙酸-甲醇、15 mmol/L 乙酸铵-甲醇和15 mmol/L 乙酸铵（0.1%乙酸）-甲醇为流动相，梯度洗脱，其中用0.1%乙酸-甲醇为流动相时，4-MHA和3-MHA分离度不理想;用15 mmol/L 乙酸铵（0.1%乙酸）-甲醇作为流动相，4-MHA和3-MHA峰型拖尾现象明显;选择15 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相，梯度洗脱，目标物色谱峰形尖锐对称。二甲苯代谢物在反相色谱柱及极性流动相中的分离和保留效果较好。考察Waters ACQUITY UPLC CSH TM C 18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C 18 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Waters ACQUITY UPLC BEH C  18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），最后选择了分离度更好的Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C 18色谱柱，在15 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液流动相体系下，可以实现4-MHA和3-MHA分离，5 种目标物的分离效果见图1。

2.2 样品前处理的优化

贝类样品含有丰富的蛋白质、磷脂、分泌黏液、色素等杂质，基质较为复杂，常用提取净化方法多为液液萃取。该研究考察了乙酸乙酯、二氯甲烷-异丙醇（5∶1）、三氯甲烷-异丙醇（5∶1）3种提取液的萃取效率，结果表明3种提取液的提取效率没有明显差别，但是二氯甲烷-异丙醇（5∶1）和三氯甲烷-异丙醇（5∶1）提取液中含有色素基质相对较多，而乙酸乙酯提取时会出现乳化现象。该研究以乙酸乙酯为提取液，优化了提取方法，为防止乳化现象，加入2.0 g氯化钠，不仅有效防止了乳化现象的发生，且在均质时最大化地分散了贝类样品，增大了样品和乙酸乙酯的接触效果，提高了乙酸乙酯的萃取效率。最后采用正己烷液液分层净化，有效消除了样品中脂肪的干扰，最终贻贝样品前处理后二甲苯代谢物回收率为85.8%～110.6%。

2.3 线性范围、精密度与检出限

在优化条件下，采用贻贝样品基质加标绘制标准工作曲线，以峰面积对相应质量浓度进行回归分析，5种苯和二甲苯代谢物在各自线性范围内呈良好的线性关系（ R 2>0.99）;以3倍信噪比为基准，得到5种化合物的方法检出限（LOD），以10倍信噪比为基准，得到方法定量限（LOQ）。具体见表2。

为验证方法的准确度，在空白贻贝样品中添加高、中、低 3个不同浓度的苯和二甲苯代谢物进行加标回收试验，按“1.2”和“1.3”条件检测，每一浓度平行测定7次。结果发现（表3），5种苯和二甲苯代谢物的平均回收率为83.40%～113.10%，相对标准偏差（RSD）不大于8.62%。