冰灯玉露愈伤组织诱导再生体系及组培苗形态建成研究

摘要 [目的]建立高效的愈伤组织诱导不定芽离体再生体系。[方法]以多肉植物冰灯玉露叶片为外植体试材，探究不同激素浓度处理对其松散型胚性愈伤组织诱导、不定芽分化、丛生芽增殖及正常形态建成、炼苗硬化的影响。[结果]冰灯玉露愈伤组织诱导最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈伤组织诱导分化不定芽最佳培养基为MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 1.0 mg/L，不定芽增殖倍数达到4.7倍，增殖苗形态健壮; 在20 ℃的培养温度、2 500 lx的光照强度下，采用1/2MS+ IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L为形态建成壮苗培养基，可获得生长形态正常（与品种特性相一致）的组培苗，减少畸形苗的产生，同时也会缩短组培苗移栽成苗的时间。[结论]该研究可为冰灯玉露的快繁技术提供支持。

关键词 冰灯玉露; 愈伤组织; 不定芽;形态建成;畸形苗

中图分类号 S 682.33  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）18-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Callus Induction and Regeneration System and Morphogenesis of Tissue Culture Seedlings of Haworthia cooperi

YANG Yu-zhen，  ZHANG Yao-wu

（Center of Plant Tissue Culture， Nanyang Vocational College of Agriculture，Nanyang，Henan 473000）

Abstract [Objective]To establish an efficient regeneration system of callus induced adventitious buds in vitro. [Method]The leaves of the succulent plant Haworthia cooperi were used as explants to explore the effects of different stimulants， concentrations and treatments on the induction of loose embryogenic callus， adventitious bud differentiation， cluster bud proliferation， normal morphogenesis， seedling refining and hardening. [Result]The results showed that the best medium for callus induction was MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L， and the best medium for adventitious bud differentiation was MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The multiplication ratio of adventitious buds reached 4.7 times， and the morphology of proliferating seedlings was robust. Under the conditions of 20 ℃ culture temperature， 2 500 lx light intensity，using 1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L as the strong seedling culture medium was established，  the tissue culture seedlings with normal growth morphology （consistent with the variety characteristics） can be obtained， which can reduce the generation of Haworthia cooperi abnormal seedlings in tissue culture rapid propagation and shorten the time of  Haworthia  cooperi tissue culture seedlings transplanting into seedlings.[Conclusion]This study can provide technical support for the rapid propagation technology of Haworthia cooperi.

Key words Haworthia cooperi;Callus;Adventitious bud;Morphogenesis;Deformed seedling

冰灯玉露为百合科十二卷属中软叶类多肉植物，原产于南非，植株低矮，叶片呈莲座状紧凑排列，叶色碧绿，叶片顶端具晶莹剔透的透明窗，“窗”大而透亮，具有较高的观赏价值，故名为“玉露”[1-2]，是百合科具有代表性的花卉品种，具有良好的市场前景，受到园艺工作者和花卉爱好者的青睐。近年来，我国和日本园艺工作者将从海外引进的玉露品种通过筛选，选择特征明显的优秀良种，再经过不同品种间相互授粉、育苗、选种的过程培育出冰灯玉露、紫肌玉露等精品玉露[1-5]，为保证这些精品玉露的优良性状，通常采用叶插和底座繁殖等无性繁殖方式，这些繁殖方法易损害母本，然而玉露本身生长速度慢，繁殖系数小，繁殖速度极慢，难以满足市场需求，导致其价格居高不下。近年来，采用组培快繁技术对多肉植物进行繁殖的研究较多，而由于常规育种一些新的性状很难通过杂交的方法获得，通过组织培养诱导愈伤组织建立遗传转化体系进行诱变育种、体细胞杂交、转基因技术等种质变异研究，是培育新品种的重要途径，因此， 获得胚性愈伤组织是种质创新育种的关键。

通过组织培养技术繁殖的商品苗，在外观形态上与分株或播种繁殖苗存在明显差异，其中组培苗基部叶片细长畸形，观赏效果差，将这些叶片去除后导致植株整体形态不完整，从而失去观赏价值。这是由于瓶中移栽出的组培苗叶片细长，厚度不足，整体植株细弱，生长势不强，有些组培苗不生根，即使生根也很细弱，且容易烂掉，导致组培苗需要数月乃至更长时间的驯化硬化阶段，新生叶才能恢复其正常的品种特征，呈现出观赏特征[ 3，6-7]，这种情况不仅增加了培养时间，提高了生产成本，还影响了商品价值，从而使这一技术的应用受限。然而，探索在组培增殖阶段和壮苗阶段克服这项技术难题，目前在该领域鲜见报道。

笔者以冰灯玉露叶片作为外植体，诱导产生松散的胚性愈伤组织[2]，进行离体再生，研究不同激素组合、培养方式对诱导松散型愈伤组织、诱导不定芽建立再生体系及建成促进正常形态的影响，建立一套完整的组织培养植株再生体系，旨在为冰灯玉露遗传变异、转基因育种及快速繁育优良新种质提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料为冰灯玉露。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的选取和预处理。将冰灯玉露基部成熟叶片摘下，用洗涤剂溶液浸泡5 min左右，用软毛刷仔细清洗，用自来水冲洗1 h。

1.2.2 外植体的灭菌与初代培养。在超净工作台上，将预处理的外植体叶片用75%乙醇溶液灭菌10 s，然后将0.1% HgC12 溶液倒入烧杯中灭菌14 min ，再用无菌水冲洗5遍后，将叶片接种在不同初代培养基上。选取MS培养基为基本培养基，3%蔗糖，0.5%琼脂，pH 5.6。以6-BA、2，4-D和NAA 3种激素的较低水平进行组合试验[2-4，8]，每处理10瓶。接种25 d后观察愈伤组织诱导情况。培养条件：光照强度2 500 lx，光照时间12 h，温度（23±1） ℃。

1.2.3 不定芽诱导培养。

愈伤组织培养一段时间后，自叶片基部切下转入不定芽诱导培养基中，选取6-BA和NAA进行不同浓度的组合配比试验[1- 6-9]，以MS培养基为基本培养基。每处理20瓶，20 d后观察不定芽诱导情况，筛选最佳增殖培养基。不定芽增殖到一定数量后，转入丛生芽增殖培养基。

1.2.4 丛生芽增殖培养。

当丛生芽长到1.5～2.5 cm，具3～4片叶时自底部切下，转入生根增殖培养基上进行继代增殖，每瓶接种5株小苗。选择1/2MS为基本培养基，以不同浓度的NAA和NAA进行增殖培养试验[ 7，9-10]，附加0.3%活性炭，接种30 d后调查幼苗生长情况。

1.2.5 不同激素对冰灯玉露形态建成的影响。

经过增殖培养获得的冰灯玉露组培苗在移栽前形态与自然生长苗存在较大差异。为了在移栽前对组培苗进行形态重建，将组培苗转移至含有不同激素的培养基上进行培养[3，7，9-10]，以获得生长外形与自然状态下一致的幼苗。每瓶加入50 mL培养基，每处理20瓶，每瓶接种2个再生苗。培养条件：25 ℃，24 h连续光照，光照强度2 000 lx。接种后每天观察再生苗的生长情况，经过约40 d培养，观察再生苗在不同培养基上的形态变化情况。

1.2.6 不同光照强度对冰灯玉露形态建成的影响。冰灯

玉露形态重建苗在炼苗移栽阶段温度和光照都会影响其性状，通常在温室温度保持在20～28 ℃时进行炼苗移栽，这时光照强度对组培苗的形态影响较大。先带瓶置于加盖遮阳网的大棚中不开盖进行过渡炼苗，7 d后逐步开盖，清洗培养基，栽植到蛭石、小石子、草炭土、粗沙混合培养土上，防止强光照射。

对比炼苗阶段不同光照强度对提高形态重建率的影响，采用4 000、3 000、2 500、2 000、1 500 lx的光照强度对冰灯玉露小苗进行炼苗硬化。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

外植体叶片在愈伤组织诱导培养基上培养25 d后，观察统计愈伤组织生长情况，结果见表1。由表1可知，使用低浓度6-BA和NAA组合愈伤组织诱导率低，愈伤组织较硬，不利于下一阶段不定芽的诱导;添加2，4-D后诱导率较高，2，4-D浓度≥0.8 mg/L时，更有利于疏松愈伤组织的诱导，浓度越高，愈伤组织越疏松，颜色越淡，甚至出现玻璃化现象。通过图1对比分析发现，添加低浓度6-BA有利于愈伤组织的形成，但浓度为1.0 mg/L时有部分不定芽萌出。综合分析可知，冰灯玉露愈伤组织最佳诱导培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈伤组织分割后继续培养能增殖出大量疏松的愈伤组织，是后期遗传转化研究和离体再生植株的最佳材料。

2.2 不定芽诱导培养中激素配比的选择 将诱导出的松散愈伤组织转移到不同浓度组合的不定芽诱导培养基中，接种后20 d调查丛生芽诱导生长情况，结果见表2。由表2可知，6-BA浓度在1.0  mg/L以下对不定芽的诱导作用不明显，添加IBA后对不定芽诱导也没有明显的促进作用，低浓度6-BA和较高浓度的NAA配比对丛生芽诱导生长有利，较高浓度的6-BA导致丛生芽分化率过高，细弱畸形，失去观赏性。从图2可以看出，配方6的生长情况最好，当6-BA浓度为0.6 mg/L，NAA为1.0 mg/L时，较有利于不定芽的分化，芽增殖倍数较高，苗健壮，叶色浓绿。因此，不定芽诱导最佳激素配比为配方6的6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L。丛生芽在诱导培养基中生长25 d左右，将丛生芽切分后转入新鲜的增殖培养基中培养。继续移入附加6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培养基中进行增殖培养，增殖倍数达4.7，每25 d左右继代1次。