半滑舌鳎养殖尾水处理系统中硝化细菌分离筛选及脱氮效果研究

摘要 从半滑舌鳎养殖尾水处理系统生物填料中分离纯化出7株细菌，用16S rDNA序列分析对分离的菌株进行鉴定，通过对7株菌株氨氮去除能力检测得到高效硝化菌株2株，并对其进行形态学观察和对养殖尾水脱氮效果的初步研究。结果表明，分离纯化得到的7株细菌分别为脱氮鲍曼氏菌（WY1）、麦氏交替单胞菌（WY3）、仙河盐单胞菌（WY4）、杜氏硫杆菌（WY5）、黄醇假交替单胞菌（WY6）、红色假交替单胞菌（WY8）和施氏假单胞菌（WY10）。经初步筛选，WY10菌株和WY4菌株的氨氮去除能力显著，去除率分别为53.99%和64.52%。革兰氏染色结果表明2株菌株均为革兰氏阴性菌，处理养殖尾水24 h后，WY4菌株氨氮、亚硝酸态氮、硝酸氮去除率分别为95.36%、99.65%、86.53%，WY10菌株氨氮、亚硝酸态氮、硝酸氮去除率分别为72.89%、94.40%、82.90%，2株菌的24 h脱氮效果显著。因此筛选出的2株硝化细菌具有调控海水养殖尾水的潜在应用价值。

关键词 养殖尾水;硝化细菌;分离纯化;16S rDNA;革兰氏染色;脱氮效果

中图分类号 S917.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）19-0110-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.19.026

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on Isolation， Screening and Denitrification of Nitrifying Bacteria in Tail Water Treatment System of Half-smooth Tongue Sole

MA Chao，CHEN Chun-xiu，WANG Yu et al

（Tianjin Fisheries Research Institute，Tianjin 300221）

Abstract Seven strains of bacteria were isolated and purified from the biological filler in the tail water treatment system of half-smooth tongue sole， and the isolated strains were identified by 16S rDNA sequence analysis.Two strains of high-efficiency nitrifying strains were obtained by detecting the ammonia nitrogen removal ability of the seven strains，and morphological observation and preliminary research on denitrification effect of aquaculture tail water were carried out.The results showed that seven strains of bacteria were isolated and purified， which were Bowmanella denitrificans （WY1），Alteromonas macleodii （WY3），Halomonas xianhensis（WY4），Sulfitobacter dubius（WY5），Pseudoalteromonas luteoviolacea （WY6），Pseudoalteromonas rubra （WY8），Pseudomonas stutzeri （WY10）.According to preliminary screening， strain WY10 and strain WY4 had significant ammonia nitrogen removal ability， with removal rates of 53.99% and 64.52%， respectively.The gram staining results showed that both strains were gram-negative bacteria. After 24 h treatment of tail water， the removal rates of ammonia nitrogen， nitrite nitrogen and nitrate nitrogen of WY4 strain were 95.36%， 99.65% and 86.53%， respectively.The removal rates of ammonia nitrogen， nitrite nitrogen and nitric nitrogen of WY10 strain were 72.89%， 94.40% and 82.90%， respectively. The denitrification effect of the two strains in 24h was remarkable.Therefore， the two nitrifying bacteria screened in this study have potential application value in regulating the tail water of mariculture.

Key words Aquaculture tail water;Nitrifying bacteria;Isolation and purification;16S rDNA;Gram staining;Denitrification effect

水产养殖快速发展在创造渔业经济的同时也产生了大量的含有有机物、含氮有害物质及抗生素等物质的养殖尾水[1-3]，大量有害物质超标的水产养殖废水直接排放会对周围水生生态系统或近海生态系统造成显著影响[4-5]。近年来，开发高效的海产养殖废水治理技术成为水产养殖的热点问题，而养殖废水中含氮元素的污染物是造成水体污染和富营养化的主要原因之一[6-7]，因此如何去除养殖废水中的含氮有害物质对海水养殖废水排放及循环利用具有重要意义。为有效解决水产养殖尾水排放所引起的环境问题，目前各界学者通过研究开发出各种水产养殖废水处理的技术，包括物理处理、化学处理和生物处理等技术[8-9]，其中生物处理技术具有环保、经济、高效等优点，在水产养殖尾水处理中应用广泛[10-12]。

氨氮主要来源于水产养殖动物的残饵、排泄物、尸体等有机物，亚硝酸盐氮则是氮元素在养殖水体循环中的一种中间产物，含有一定毒性，高浓度氨氮及亚硝酸盐氮的养殖水体不仅严重危害水产动物的正常生长发育及导致病害频发，还会对周边生态环境造成恶劣的影响[ 13-14]。而生物处理技术中主要是通过微生物调控来实现水产养殖尾水脱氮处理，目前生物脱氮技术已经成为该领域的研究热点，国内外学者从环境中分离筛选出多种高效脱氮细菌，包括芽孢杆菌（Bacillus）[15-17]、假单胞菌（Pseudomonas）[18-19]、不动杆菌（Acinetobacter）[20]、红球菌（Rhodococcus）[21]等细菌，因此筛选高效的脱氮细菌并应用到水产养殖尾水处理中，是调控养殖水体、保持循环养殖水体水质良好、实现绿色养殖的有效途径。

该研究通过对半滑舌鳎养殖尾水处理系统生物填料中细菌进行分离、筛选、鉴定，并对其在养殖尾水中脱氮效果进行初步研究，对提高海水养殖水体处理系统的脱氮效率具有指导作用。

1 材料与方法

1.1 样品来源

该试验菌株分离筛选自天津汉沽区半滑舌鳎工厂化养殖系统尾水处理中的生物填料。

1.2 菌株分离及纯化

取生物填料的水样悬液10 mL，用无菌水稀释制备成10-1的稀释液，取0.1 mL涂布在异养硝化固体培养基上，在培养箱中28 ℃恒温培养2～3 d，再挑取不同形态特点的菌落分离纯化3次以上直到获得单一的菌落为止。镜检验纯并采用甘油保存法-80 ℃保种。

1.3 16S rDNA序列测定及同源性比较

将分离纯化的菌株送往上海微基生物科技有限公司进行16S rDNA序列测序，所得结果与NCBI数据库进行同源性比对，最后得出同源性最高的物种。

1.4 高效硝化细菌筛选

将分离纯化的菌株分别接种至装有100 mL异养硝化液体培养基的250 mL锥形瓶中富集培养，在培养箱中28 ℃、120 r/min培养24 h。再将富集后的菌悬液再次分别以1%的接种量接种至分别装有异养硝化培养基的250 mL锥形瓶中，于培养箱中28 ℃、120 r/min培养24 h后，移取摇匀的10 mL菌液，用离心机8 000 r/min离心后取上清液，检测其中氨氮浓度。测定方法参照海洋监测规范（GB 17378.7—2007）与《水和废水监测分析方法》进行。根据氨氮去除率，初筛出高效的硝化细菌。

1.5 高效硝化菌株形态学鉴定及脱氮性能初步研究

1.5.1 菌株形态学鉴定。

将初筛的高效硝化细菌接种于固体培养基平板，在培养箱中28 ℃条件下培养24 h后在显微镜下观察、记录菌落特征。在平板上选取单菌落挑于涂片上固定并进行革兰氏染色，在显微镜下观察、拍照和记录菌落形态特点，随后对筛选菌株进行扫描电镜观察并拍摄照片。

1.5.2 初筛菌株对养殖尾水的脱氮效果初步研究。

从半滑舌鳎工厂化养殖系统尾水处理池取养殖尾水，抽滤后，分装到18个锥形瓶中，每瓶250 mL，向各水样瓶中分别以1%的接种量接入2株筛选得到的菌株（每组3个平行）。接种后，将水样置于28 ℃、120 r/min培养箱中培养24 h，24 h后取出水样测定水体中氨氮、硝态氮、亚硝态氮的含量，测定方法参照海洋监测规范（GB 17378.7—2007）与《水和废水监测分析方法》进行。

1.6 数据分析

使用SPSS 20.0软件对所有试验数据进行单因素方差分析，试验数据均以平均值±标准差表示。采用Excel软件对试验数据进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化及初步鉴定

采集的生物滤池填料样品经分离纯化出7株形态大小不同的菌株，分别命名为WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10，将所测7株菌株的16S rDNA测序结果与GenBank数据库中核酸序列进行比对，结果显示，WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10分别与脱氮鲍曼氏菌（Bowmanella denitrificans）、麦氏交替单胞菌（Alteromonas macleodii）、仙河盐单胞菌（Halomonas xianhensis）、杜氏硫杆菌（Sulfitobacter dubius）、黄醇假交替单胞菌（Pseudoalteromonas luteoviolacea）、红色假交替单胞菌（Pseudoalteromonas rubra）和施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）同源性最高，其初步鉴定结果见表1。

2.2 高效硝化菌株筛选

为进一步筛选出能够高效进行硝化作用的菌株，对7株菌株进行了氨氮去除能力检测，图1为7株菌株在氨氮初始浓度为101 mg/L的异养硝化培养基中接种24 h后的氨氮去除率，结果表明，分离纯化的7株菌株对氨氮均有一定的去除能力，其中WY10的氨氮去除率最高，为64.52%，其次为WY4的53.99%。因此，选择WY4和WY10为目标菌株进行下一步研究。