切花小菊“红昌”脱毒技术研究

摘要 以切花小菊“红昌”为试验材料，对病毒唑预脱毒，热处理结合微茎尖脱毒的技术进行了探究。结果表明：病毒唑浓度10mg/L对小菊进行预脱毒，温度25～39℃热处理无菌苗，脱毒率达92.50%。茎尖大小为0.1～0.3 mm时，经RT-PCR检测，小菊的脱毒率极显著高于其他处理，高达89.00%，植株茎秆粗壮，叶片浓绿。剥离茎尖时采用茎尖固定培养基，能够有效减缓茎尖的水分流失，提高茎尖成活率，成活率为60.00%。以不同的茎尖诱导培养基培养茎尖，改良MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L为最佳培养基，成活率最高为53.33%，茎尖生长速度快，长势好。

关键词 病毒唑;热处理;微茎尖脱毒;切花小菊

中图分类号 S382.1+1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）19-0114-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.19.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Virus-free Technique of Cut Chrysanthemum “Hongchang”

LIU Dan，WANG Rong，CHEN Tian-lang et al

（Zhejiang Hifun Life Co.， Ltd.，Shaoxing， Zhejiang 312000）

Abstract Flower Chrysanthemum “Hongchang” was used as experimental material，the techniques of predetoxification of ribavirin， heat treatment combined with micromeristem tip detoxification were studied.The results showed that the virazole concentration was 10 mg/L for pre virus-free treatment， and the temperature was 25-39 ℃ for heat treatment of sterile seedlings， which was the best treatment method for heat treatment combined with stem tip virus-free treatment， with the virus-free rate reaching 92.50%. When the stem tip size was 0.1-0.3 mm， RT-PCR detection showed that the difference of virus-free rate was significantly higher than that of other treatments， up to 89%. The plant had strong stems and thick green leaves. When peeling off the shoot tip， the fixed shoot tip medium could effectively slow down the water loss of the shoot tip， and improve the survival rate of the shoot tip， which was 60%. Different shoot tip induction media were used to culture shoot tips. Modified MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1mg/L+activated carbon 0.5 g/L+sucrose 30 g/L+agar 5 g/L was the best medium. The highest survival rate was 53.33%， and the shoot tip grew fast and grew well.

Key words Ribavirin;Heat treatment;Micromeristem tip detoxification;Cut Chrysanthemum

菊花（Chrysanthemum morifolium），为菊科菊属多年生宿根草本花卉，是我国的传统名花，被誉为花卉“四君子”之一[1]。目前切花菊栽培地域广泛，在花卉产业中占有重要地位，作为世界四大切花之一，在生产规模上居于世界各类切花之冠[2]。切花菊又分为多头和单头两大类，多头切花菊又称切花小菊[3]，小菊的一个茎秆上有多个花蕾，一般为5～7个，花朵直径6 cm以下，主蕾与侧蕾长势均衡，花期接近，呈伞形花序，观赏价值和经济价值极高，在国内和国际市场的需求量迅速增加。为了满足市场需求，近年来，菊花栽培面积不断扩大[4]，但菊花的病毒病越来越严重。已报道侵染菊花的病毒有20余种[5]，如番茄不孕病毒（Tomatoa spermy virus，TAV）是危害菊花的主要病毒之一[6]。TAV 为黄瓜花叶病毒属的成员[7]。侵染TAV病毒的菊花植株表现矮化、变形、碎花、花叶、皱缩、坏死等现象[8]，严重影响菊花的品质和产量，阻碍菊花产业的发展。笔者以切花小菊“红昌”为试材，探究菊花脱毒技术，以期为脱除菊花病毒及解决品种退化提供技术和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料 供试脱毒材料：经鉴定感染TAV病毒的小菊“红昌”（采自浙江海丰花卉有限公司种植基地），该小菊为扦插培养18 d后得到的小菊幼苗，处于营养生长时期。

1.2 方法

1.2.1 病毒唑预脱毒。

用一次性注射器在距离地面2 cm的小菊“红昌”植株茎秆上注射病毒唑溶液，溶液浓度分别为0（CK）、5、10、15、20mg/L。培养条件：空气湿度为50%～75%，环境温度为15～30 ℃，光照时间为14 h/d，光照强度为50 000～100 000 lx。培养期间注意防虫防菌，培养30 d后得到预脱毒小菊。

1.2.2 外植体的无菌培养。

选取获得的预脱毒小菊当年生嫩枝，剪去叶片，将其茎段剪成带4～5个芽的小段，在洗洁精水中浸泡10 min，取出将每个带芽茎段单独用自来水流水冲洗1 min;然后将清洗后的带芽茎段在多菌灵1 000倍液中浸泡30 min，取出单独用自来水流水冲洗1 min;在超净工作台上将清洗后的带芽茎段在75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用无菌水冲洗2次;最后将冲洗后的带芽茎段在有效氯为5%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，取出用无菌水冲洗6次，每次冲洗1 min，得到消毒灭菌后的茎段。将获得的茎段切成长2～3 cm的小段，每个小段带有1～3个腋芽，同时切除茎段两端2～3 mm接触药品的部位，将其接种于含有不定芽诱导培养基MS（3/4大量元素）+6-BA 0.2mg/L+蔗糖30g/L的组培瓶内进行初代培养。25 d继代培养一次，继代培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.5 g/L。培养条件：温度为（22±2）℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为14 h/d。

1.2.3 热处理结合茎尖培养脱毒。

将继代培养基中培养6 d得到的无菌瓶苗在光照培养室中培养7 d后置于光照培养箱内，采用昼夜变温的方式进行热处理，进一步提高茎尖的脱毒率。设置2种热处理方式：处理T 热处理35 d;第1～5天：白天（8：00—20：00）高温28 ℃，晚上（20：00—次日8：00）低温25 ℃;第6～12天：白天（8：00—20：00）高温33 ℃，晚上（20：00—次日8：00）低温28 ℃;第13—35天：白天（8：00—20：00）高温39 ℃，晚上（20：00—次日8：00）低温33 ℃，湿度均为30%～50%。处理T 光照时间12 h/d，光照强度3 000 lx，按昼夜温度28～32、30～35、33～38 ℃的顺序，每2 d变换1档。然后在33～38 ℃下继续热处理脱毒培养30 d。热处理培养后进行茎尖剥离。

1.2.4 茎尖剥离、接种与培养。

将经过热处理的无菌苗在超净工作台上用镊子和刀片切下菊苗顶端1～2 cm，接种于含有茎尖固定培养基MS+琼脂5 g/L的培养皿中，以防在茎尖剥离过程中由于脱水而影响成活率（以不使用茎尖固定培养基直接剥离作为对照）。在40倍解剖镜下，一手用镊子轻轻将材料固定于视野中，另一手用11号手术刀将菊花顶芽外的幼小叶片小心依次剥离，注意操作过程中不要过早折断茎，以免增加剥离难度，直至在解剖镜下能看清表面光滑、呈圆盘状轻微发亮的茎尖为止。用手术刀割取茎尖组织，大小分别为0.1～0.3、0.8、1.5、1.9 mm，然后迅速接种于茎尖诱导培养基中进行培养，pH 6.0，接种时轻轻放置于培养基表面，避免将茎尖深埋培养基中。培养条件：温度为（22±2） ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为14 h/d，30 d后统计茎尖成活率。

茎尖成活率=（茎尖成活数/接种茎尖总数）×100%

茎尖诱导培养基的不同配方：CHR- 改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L;CHR- MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L;CHR- ZL+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L;

CHR-4，1/2B5+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L（ZL为申请公布号为“CN109258460A”发明专利中的培养基组成成分）。

1.2.5 病毒检测。

对所得的小菊植株（茎尖组织培养苗）进行TAV检测，统计脱毒率确定脱毒效果。

脱毒率=（脱毒植株数/热处理植株数）×100%

1.2.6 增殖培养。

将获得的经鉴定确认不携带TAV病毒的小菊植株接种至增殖培养基中进行增殖培养，培养条件：温度为（22±2） ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为14 h/d。

1.2.7 生根培养。

将增殖后的脱毒植株切成2 cm左右并带有1～3个叶芽的茎段，接种于生根培养基中进行生根培养。培养条件：温度为（22±2） ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为14 h/d。

2 结果与分析

2.1 供试脱毒材料的鉴定

经RT-PCR检测，小菊“红昌”脱毒前感染TAV的结果呈阳性（图1）。

2.2 病毒唑预脱毒对脱毒率的影响

由表1可知，采用不同浓度病毒唑对小菊进行预脱毒处理，小菊的脱毒率不同，以处理③的脱毒率最高，达92.50%;CK的脱毒率最低。部分茎尖组织培养苗的病毒检测结果呈阳性（图2），说明病毒唑预脱毒对菊花脱毒有重要作用。

2.3 热处理温度对脱毒率的影响

由表2可知，2种不同热处理方式对小菊脱毒率的影响呈极显著差异;处理T 病毒唑浓度及茎尖剥离大小均一致时，热处理温度采用25～39 ℃的方式，脱毒率极显著高于处理T 达92.50%。因此，热处理温度为25～39 ℃是热处理结合茎尖脱毒的最佳温度。无菌瓶苗在热处理前状态见图 热处理后状态见图4。