水处理周期中微生物群落结构的变化

摘要   ［目的］探究水处理周期中微生物群落的动态变化情况。［方法］采用EPS泡沫滤珠作为生物滤料开展水处理试验，通过水质指标氨氮、亚硝酸盐、TOC的测定来评估其水质处理效果，另采用Illumina miseq高通量进行水体中细菌的16S rRNA基因V3+V4区的测序，通过分析微生物群落结构及多样性来探究整个水处理周期中的微生物群落结构变化。［结果］在10 d的水处理过程中，氨氮、亚硝酸盐、TOC的最终去除率分别可达98.0%、99.0%和95.0%以上，在第5天时水质情况趋于稳定。分析不同时间水体中细菌丰度及多样性的变化发现，水体中的微生物丰富度在第9天最高，群落多样性在第5天最高。整个周期中优势细菌在门分类上变化不大，变形菌门在水体中占主要优势，在前3 d占比达95.00%以上，第5天之后从77.79%逐渐下降至63.57%；在属分类层面上，水体中细菌丰富度属类差异较大，其中弧菌属在第1天占比为2.97%，第3天迅速增殖至98.07%，第5天下降至8.38%，蛭弧菌属在前3 d呈现低占比（0.08%～0.16%），第5天呈现一个峰值，占比为18.53%，第7天后逐渐下降。［结论］EPS水循环系统水处理效果良好，且推测在前5 d的水处理过程中，变形菌门和蛭弧菌属在水处理过程中发挥重要作用。

关键词 水处理；微生物群落；动态变化

中图分类号 X 172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）20-0054-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.20.015

Changes of Microbial Community Structure during Water Treatment Cycle

ZHANG Xia，XU Zhi-jin，LI Wei-ye et al

（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan，Zhejiang 316000）

Abstract ［Objective］To explore the dynamic change of microbial community in water treatment cycle.［Method］ The EPS foam filter beads was used as biological filter material for water treatment test.Through the water quality index ammonia nitrogen，nitrite nitrogen，TOC to evaluate its water quality treatment effect，and using Illumina miseq high throughput of bacteria 16S rRNA gene V3+V4 region sequencing in water，to analyze the structure and diversity of microbial community structure throughout the water treatment cycle.［Result］The final removal rates of ammonia nitrogen，nitrite nitrogen and TOC could reach more than 98.0%，99.0% and 95.0% in the 10-day water treatment process，the water quality situation stabilized on the 5th day.By analyzing the changes of bacterial abundance and diversity in water at different times，it was found that the microbial richness in water was the highest on the 9th day，the community diversity was the highest on the 5th day.In the whole cycle，the dominant bacteria had little change in phylum classification，and the Proteobacteria had a major advantage in water.In the first three days，it accounted for more than 95.00%，and after the fifth day，it gradually decreased from 77.79% to 63.57%.On the level of genus classification，the bacterial richness in water was significantly different among genera.Vibrio accounted for 2.97% on the first day，rapidly increased to 98.07% on the third day，and decreased to 8.38% on the fifth day.Bdellovibrio showed a low proportion of （0.08%-0.16%） in the first three days，and a peak of 18.53% in the fifth day，and gradually decreased after the seventh day.［Conclusion］The treatment effect of EPS water circulation system is good.It is speculated that Proteobacteria and Bdellovibrio plays an important role in the water treatment in the first 5 days.

Key words Water treatment;Microbial community;Dynamic changes

水产养殖总产量和集约化程度日益增加，我国养殖产量已占世界养殖产量的 60% 以上［1-2］，随之而来的尾水处理问题已经成为研究的焦点。在目前的工厂化循环水养殖中，生物滤池是重要的水处理环节。而微生物群落结构是影响生物滤池的水处理效果的重要因素［3］，这使得研究水处理周期中的微生物群落结构变化具有重要意义。

水处理系统中微生物群落结构与养殖环境因子息息相关。陈琛等［4］研究发现养殖密度会显著影响凡纳滨对虾养殖水体中微生物群落特征。程璐璐等［5］研究发现缓释碳源生态基质的添加可使系统优势菌属生物占比发生变化，假单胞菌（Pseudomonas） 占比增加，脱氮效果得到提高；包鹏等［6］研究发现低溶解氧可以引起较高的生物多样性，而高溶解氧则更利于硝化功能菌（Proteobacteria 菌门的 Nitrosomonas 菌属、Nitrospirae 菌门的 Nitrospira 菌属）的富集。以上研究表明，养殖环境因子不仅会影响养殖对象的生理状态，也会改变养殖环境中微生物群落结构。

碳源的添加方式是反应器运行效果的影响因素之一。Ciggin等［7］研究表明分次添加碳源的方式比连续添加更加能促进微生物的生长。张万友等［8］研究表明分次添加碳源的处理方式在处理序批式反应器（sequencing batch reactor，SBR）中更加有利于提高反硝化效率。张兰河等［9］对碳源投加方式对SBR工艺脱氮速率的影响的研究结果也表明分次添加碳源能够提高有机物质的反应速率和总氮去除率。而碳源添加后在水处理周期对微生物群落多样性结构的影响鲜见报道。该研究拟通过对配置黑石斑循环水人工废水的水处理效果和微生物群落的动态变化进行研究，为今后深入开展微生物菌落调控水处理效果提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取聚苯乙烯泡沫滤珠（EPS）作为生物滤料，放置在自行设计的简易的循环水系统，进行生物挂膜水处理。装置上部为40 L的滤料桶（直径25 cm，高81.6 cm），其中装有20 L滤料，下部为直径120 cm、高70 cm的蓄水桶，盛放水体约400 L，通过水泵（流量2 600 L/h）实现下进水、上出水循环，滤料∶水体体积比为1∶20。滤料图和水处理装置图见图1～2。

1.2 试验方法

1.2.1 水处理试验。

根据前期水处理挂膜试验条件配置黑石斑循环水人工废水400 L［10］，使得水体指标初始值氨氮（NH4+-N）约为2.5 mg/L，亚硝酸盐（NO2--N）约为5 mg/L，磷酸盐（PO43--P）约为0.5 mg/L，硝酸盐（NO3--N）约为0.5 mg/L。添加葡萄糖71 g使得水体中总有机碳（TOC）约为80 mg/L（TOC-葡萄糖配制标准曲线 y=460.32x-1.922 1，R2=0.999 3），初始碳氮比设置为TOC∶无机氮≈10∶1，设置3个重复开展水处理试验，试验过程中不换水，试验周期为11 d。

1.2.2 水质测定。

前6 d每天统一时间取样测定水体中氨氮和亚硝酸盐，后4 d，每隔1 d测定水中氨氮和亚硝酸盐。氨氮测定采用GB 17378.4—2007次溴酸盐氧化法，亚硝酸盐测定采用GB 17378.4—2007萘乙二胺分光光度法，采用总有机碳分析仪 TOC-LCPH CN200测定水体中TOC浓度。

1.2.3 水体中微生物多样性检测。每隔1 d取滤膜测定微生物多样性。水体微生物取样：每个桶各取水样2 L，经0.22 μm 滤膜过滤，每组混合为1个样本。样本记录为D1、D3、D5、D7、D9、D11。

DNA提取并扩增测序分析：采用DNeasy PowerSoil Kit（50）（MoBio）试剂盒提取DNA，并采用引物进行16S rDNA V4高可变区的PCR扩增，具体扩增方法参照文献［10］，扩增产物送至上海欧易生物医学科技有限公司进行测序。

1.3 数据分析

水质试验数据采用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据分析和差异显著性检验（α＝0.05）。

测序数据由 Illumina miseq 测序获得原始双端测序数据，先需要进行去杂、拼接、嵌合体序列处理，获得较为优质的序列 valid tags，再进行分类 OTU、系统发育树、Alpha和Beta 多样性等分析。

2 结果与分析

2.1 水体中氨氮、亚硝酸盐、TOC的变化

由图3可知，在水处理过程中，氨氮出现2个波峰，分别在第1天和第3天，在第2天氨氮的去除率可达63.0%，在第4天后氨氮趋于稳定，最终去除率可达98.0%以上；亚硝酸盐和TOC浓度呈下降趋势，在第1天时下降速率最快，到第4天有轻微的增长，后续下降后趋于稳定，在第2天亚硝酸盐去除率可达81.2%，TOC去除率为73.4%，最终去除率分别可达99.0%和95.0%以上。

2.2 不同时间水体中细菌丰度及多样性的变化

从表1可以看出，在循环水处理周期中，微生物原始序列呈增长再平缓最后下降的趋势，有效序列在第3天（D3）显著高于其他各组；操作分类单元数量在第3天最少，为128，第5天（D5）之后为730以上，显著高于第3天；通过比较3个样品细菌丰富度情况，从Chao指数可以看出微生物丰富度在第9天（D9）最高，从Shannon指数、Simpson指数发现群落多样性在第5天最高，最低的为第3天。

2.3 不同时间水体微生物Alpha多样性指数分析和物种间相似性的变化

从Rank Abundance曲线可以看出样品所含物种的丰富程度和均匀程度。曲线在横轴上的长度越宽表示物种组成越丰富，而在纵轴上跨度越小、曲线越平坦表示物种组成均匀程度越高。图4表明，D3的微生物物种组成相较于其他各组最为丰富，最为均匀，其次是D1、D9。根据OTU注释结果，绘制6个样本的微生物物种间相似性的聚类图包括样本间聚类关系树（图5），可以看出自第5天之后，水体中物种相似性越来越高。