犬黑皮质素受体-4突变体D298N真核表达载体的构建及其在MDCK细胞中的表达

摘要 ［目的］引进犬MC4R突变点，构建突变体D298N表达载体并在MDCK细胞中获得表达。［方法］设计带突变点D298N引物，以犬MC4R基因组DNA为模板，采用普通PCR和Overlap-PCR扩增编码区，将产物克隆、酶切、测序鉴定。将测序正确的基因连接到pcDNA3.1-myc-His/A载体上，将重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D298N酶切、鉴定，将测序正确的重组体转染到MDCK细胞中，继续培养3 d，提取细胞总RNA，并采用RT-PCR方法检测基因表达。提取细胞总蛋白，Western Blot鉴定蛋白表达。［结果］构建带D298N突变点的真核表达载体，提取质粒后有2处碱基不同，分别是777位碱基T→C ，892位碱基G→A（引入的突变位点）。转染到MDCK后，RT-PCR和Western Blot均检测到重组体在基因水平和蛋白水平的表达。［结论］成功构建犬的重组体真核表达载体并在MDCK细胞中表达。

关键词 犬；黑皮质素受体-4；真核表达载体；定点诱变；D298N；MDCK细胞

中图分类号 Q 782  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）20-0076-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.20.020

Construction of Canine Melanocortin Receptor-4 Mutant D298N Eukaryotic Expression Vector and Its Expressed in MDCK Cells

SONG Li-xian，LIU Chun-hong，WANG Zhan-qing et al

（Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Yantai，Shandong  264100）

Abstract ［Objective］The canine MC4R mutation site was introduced，the mutant D298N expression vector was constructed and expressed in MDCK cells.［Method］We designed D298N primers with mutation site .Using canine MC4R genomic DNA as template，we amplified the coding region of mutation MC4R by normal PCR and overlap PCR.The product was cloned，digested by enzymes and sequenced.The correctly sequenced gene was connected to pcDNA3.1-myc-His/A vector.The recombinant pcDNA3.1-myc-His/A-D298N was digested by enzymes and identified;The correctly sequenced recombinant was transfected into MDCK cells and cultured for 3 days.The total RNA was extracted and the gene was detected by RT-PCR;The total protein was extracted and the protein was identified by Western blot.［Result］The eukaryotic expression vector with D298N mutation was constructed.We extracted the plasmid.There were two different bases in the recombinant expression plasmid，which were 777 base T→C，892 base G→A（here is the introduced mutation site）.After MDCK cells transfecting，the expression of recombinant at gene level and protein level was detected by RT-PCR and Western blot.［Conclusion］The recombinant eukaryotic expression vector of canine was successfully constructed and expressed in MDCK cells.

Key words Canine;Melanocortin receptor 4;Eukaryotic expressive vector;Site-directed mutagenesis;D298N;MDCK cell

黑皮质素受体系统由5个密切相关的G蛋白偶联受体组成（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）。这些受体参与包括人类在内的多细胞动物许多重要的生物学过程［1］。研究发现，黑皮质素途径在体重调控中起着重要作用，下丘脑黑皮质素信号的增强导致食物摄入减少和能量消耗增加。单基因肥胖伴MC4R功能障碍与能量平衡调节密切相关。此外，MC4R基因突变与单基因肥胖和普通肥胖均有显著相关。MC4R基因突变与脂肪量和肥胖相关（FTO）基因的相互作用显著增加肥胖风险，尤其是青少年［2］。据文献报道，在美国有近12 800名肥胖患者与MC4R的缺陷有关［3］。

研究发现，有超过15亿的成人和儿童面临肥胖的困扰，肥胖已经作为公共健康问题受到人们的广泛关注，严重威胁人类健康［4］。全球疾病负担小组估计，2015年BMI值升高导致400万人死亡，其中2/3的人死于心血管疾病（CVD）［5］。肥胖与2型糖尿病的关系早已被人们所认识，并清楚地解释了许多国家2型糖尿病的高患病率。许多肥胖高危患者的特征是代谢和心血管危险因素并存［6］。众所周知，过度肥胖对流感易感性增加，包括近年在全世界范围流行的新型冠状病毒，对人类的危害堪称是灾难性的。人们通常认为，饮食结构不恰当和缺乏运动是导致肥胖的主要原因，但是有些人即使是健康的生活方式，仍然会面临肥胖的困扰，因为导致肥胖的原因除了生活方式，还有基因因素参与［7］。有学者在对UK生物银行的0.5亿份样本进行筛查，发现了61个MC4R突变体，通过分析发现，均与BMI、肥胖相关代谢性心肌病密切相关［8］。因此，迫切需要深入探究MC4R突变导致的肥胖。

MC4R是一个有996个碱基配对的七次跨膜受体，定位染色体18Q21.3上，主要分布于下丘脑［7］。犬被认为是研究人类疾病和包括肥胖在内的功能失调机制的理想生物医学模型［9］。犬MC4R基因由编码332个氨基酸的单一外显子组成，定位在1号染色体上，在各物种之间存在高度同源性［10］。为了探讨MC4R突变和肥胖之间的关系，笔者成功构建了犬 D298N突变体的真核表达载体，后将其导入MDCK细胞内，旨在为进一步探讨MC4R突变引起的蛋白功能变化提供信息，同时也为人类肥胖的基因治疗提供科研数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞系。带His标签的pcDNA3.1载体、DH5α、PMD18-T Vector、MDCK细胞。

1.1.2 主要试剂。

Beagle犬新鲜血液；聚合酶rTaq DNA、X-Gal、异丙基硫代半乳糖苷、限制性内切酶（XhoⅠ和BamH I）、DNA Marker、T4-DNA 连接酶、RNA PCR提取试剂盒；Trizol Reagent、培养基、Anti-myc 抗体；G418抗生素、FuGENE HD 转染试剂盒；胎牛血清等。

1.2 方法

1.2.1 引物设计。根据GenBank犬MC4R基因，设计引物序列：

上游引物A，5′-CGGGATCCGCCAGGATGAACTCCACCCTTCAGC-3′；

中间引物B，5′-ATGAGAGGGTTGATGATGGAG-3′；

中间引物C，5′-CTCCATCATCAACCCTCTCAT-3′；

下游引物D，5′-CCGCTCGAGGTATCTGCTAGACAAGTCAC-3′。

引物AB扩增基因长度为115 bp，引物 CD扩增基因长度为902 bp，引物AD扩增基因长度为1 019 bp。

1.2.2 提取犬血DNA，扩增D298N突变体基因PCR。

（1）以引物AB、CD进行PCR反应获得基因片段，分别命名为产物AB、CD。扩增完毕取目的产物20 μL，用凝胶电泳进行检测，然后将凝胶进行回收、纯化，取2 μL进行电泳检测。

（2）以引物AB、CD产物为模板，用引物A、D进行PCR反应获得突变体的DNA片段。扩增完毕取目的产物20 μL，用凝胶电泳进行检测，然后将凝胶进行回收、纯化，取2 μL进行电泳检测。

1.2.3 获得的DNA片段进行TA克隆、测序。

将突变体D298N的DNA片段连接到pMD18-T载体，命名pMD18-T-cMC4R-D298N，转化到DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，提取质粒，用BamH I、Xho I进行酶切鉴定，筛选阳性质粒送测序，并与犬MC4R基因序列进行比较。

1.2.4 重组真核表达载体构建、测序。

用BamH I、Xho I将TA克隆阳性质粒和带His标签的pcDNA3.1真核表达载体进行双酶切、电泳，回收目的片段。用T4 DNA连

接酶将带His标签的pcDNA3.1真核表达载体和MC4R片段在16 ℃条件下14 h进行连接，将产物转化到DH5α细胞，用抗生素平

板筛选，挑取单克隆菌落鉴定。测序正确后扩大培养，提取

质粒DNA。

1.2.5 将基因转染到MDCK细胞。

将处于对数生长期的MDCK细胞重悬在培养基中，接种细胞，培养24 h，使细胞融合率达75%，把空质粒及重组质粒转染到MDCK细胞内。转染24 h后，继续培养1～2 h，收集细胞。

1.2.6 用RT-PCR方法检测基因的表达。

转染3 d后，提取未转染细胞、空载体转染细胞、重组体转染细胞的总RNA，进行凝胶电泳检测。用RNA PCR 试剂盒进行RNA反转录。用cDNA做模板，引物A和D进行PCR反应。取20 μL PCR产物，用凝胶电泳检测。

1.2.7 用Western blot方法检测蛋白的表达。

转染3 d后，用EDTA-胰酶对未转染的细胞、空载体转染细胞、重组体转染细胞进行消化，并提取蛋白质，将蛋白质进行定量检测（分光光度计），然后灌胶、点样、电泳、转膜、封闭，加入His抗体，孵育过夜，与羊抗鼠二抗反应、显色。

2 结果与分析

2.1 犬的基因组DNA条带

用Beagle犬的新鲜全血提取DNA，结果见图1。

2.2 犬突变体D298N-MC4R目的片段电泳结果

用overlap PCR技术首先扩增115和902 bp 2个片段，再以这2个扩增得到的片段为模板，扩增D298N-cMC4R目的片段，扩增产物约1 000 bp（图2） 。