根际促生菌S1菌株的分离鉴定及促生效果

摘要 ［目的］筛选出更多新型、高效的植物根际促生菌，研发绿色环保的微生物肥料及植物生长调节剂。［方法］从广西北海互花米草根际采集土壤样品，采用稀释平板法分离土壤样品中的微生物。通过检测菌株分泌IAA和溶磷的能力，从分离的产物中筛选出解磷能力强及IAA高产菌株，并制备菌株发酵液对番茄种子和幼苗分别进行浸种和灌根，培养到适宜时间后测定种子和幼苗的各生长指标。［结果］发酵液浓度为1×104 CFU/mL时能够显著促进番茄种子萌发和幼苗生长。经16S rRNA及生理生化鉴定，该菌株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。［结论］筛选出1株具有溶磷、分泌生长素性能的根际优良促生菌株——阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），该菌株对番茄种子的萌发及幼苗的生长有显著的促进作用。

关键词 植物根际促生菌；阴沟肠杆菌；微生物肥料；番茄

中图分类号 S 154.3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）20-0081-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.20.021

Isolation and Identification of Plant Growth Promoting Rhizobacteria S1 and Determination of Its Effect on Growth Promotion

L Zhao-yang， WANG Wei， YANG Miao-ling et al

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100193）

Abstract ［Objective］In order to screen out more new and efficient plant rhizosphere growth-promoting bacteria， and to develop green and environmental friendly microbial fertilizer and plant growth regulator.［Method］Soil samples were collected from the rhizosphere of Spartina alterniflora in Beihai， Guangxi. Microorganisms were isolated by dilution plate method. By detecting the ability of the strains to secrete IAA and solubilizing phosphorus， the strains with strong phosphorus solubilizing ability and high IAA yield were selected from these strains， and then the strain fermentation broth was prepared to soak and irrigate tomato seeds and seedlings. After the cultivation to the appropriate time， the growth indexes of the seeds and seedlings were measured. ［Result］The results showed that when the concentration of the fermentation broth was 1×104 CFU/mL， it could significantly promote tomato seed germination and seedling growth. The strain was identified as Enterobacter cloacae by 16S rRNA. ［Conclusion］A strain of Enterobacter cloacae， an excellent rhizosphere growth-promoting strain with the properties of dissolving phosphorus and secreting auxin， was screened out. The strain had a significant promoting effect on the germination of tomato seeds and seedling growth.

Key words Plant growth promoting rhizobacteria;Enterobacter cloacae;Microbial fertilizer;Tomato

根际土壤是土壤中各种物质和养分从无机环境进入植物的重要媒介，它受植物根系分泌物、微生物与土壤之间的相互作用［1］，根际土壤微生物作为土壤-植被生态系统中最活跃和具有决定性影响的组分之一，不仅能够参与并调节植物在生长发育中的各个环节［2-3］，还在土壤的能量流动、养分循环及有机物质转化中发挥着重要作用。其中，根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指自由生活在植物体内，附生于根系或根际土壤中的一类对病原菌有生防作用，能够促进植物吸收矿物质等无机物，并产生有利于植物生长的化合物的有益菌，这类土壤益生菌通常也具有生物固氮、产生植物激素和抗生素等能力［4-6］。PGPR由于对植物病害具有显著防效，并能够促进作物的生长发育及增加产量而受到研究者的关注，成为根际微生物研究的热点。引入外来微生物定植到根际能够直接影响根际微生物的数量和结构，或者通过调控植物的代谢和根分泌物组分而间接影响植物根际微生物结构，进而影响植物的生长发育、抵抗病原微生物的能力等［7-10］。

互花米草（Spartina alterniflora），禾本科米草属多年生植物，其茎秆粗壮且根部发达，能够深扎于土壤中以促进泥沙的快速沉降和淤积，因此被许多国家地区引进［11］。但互花米草的过度扩散对生态系统造成严重影响，已成为生物入侵研究的焦点之一［12］。研究发现，互花米草能够改变土壤微生物群落，提高根际微生物的丰富度［13-15］。因此，在互花米草根际土壤中更有可能筛选出更多种类的根际促生菌，为研发新型绿色微生物肥料和生长调节剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品。

试验土样采集于广西北海互花米草根际土壤，拨去表层约5 cm厚的土壤，用小铲采集根际土壤并将其装入无菌采样袋中，标注好采样时间和地点，带回实验室置于冰箱中-4 ℃保存备用。

1.1.2 番茄品种。

试验所用番茄品种为改良毛粉802，购自山东安信种苗股份有限公司。

1.1.3 培养基。

生长素产出菌筛选培养基：R2A（M1）；菌株溶磷能力筛选培养基：蒙金娜无机磷培养基（M2）；微生物分离培养基：LB固体培养基（M3）；菌株产IAA能力筛选培养基：Salksowski 比色液（M4）。培养基的配制成分与含量见表1［14］。

1.2 试验方法

1.2.1 根际微生物的分离与筛选。

1.2.1.1 菌株的富集和分离。取2 g土壤样品加入18 mL无菌水，在摇床上振荡培养1 h后静置10 min，使形成的土壤悬浮液分层。取2 mL上清液于LB液体培养基中，在摇床上振荡24 h进行富集培养。取1 mL富集后的菌株悬浮液，用无菌水将悬浮液浓度调节至1×10-2 CFU/mL，之后采用梯度稀释法将浓度稀释至1×10-7 CFU/mL，分别吸取各梯度土壤悬浮液 200 μL，依次滴加至ACC筛选平板上，用无菌涂布棒均匀涂布至干燥，每个处理设置3个重复。将完成涂布分离的平板倒置培养在34 ℃的培养箱中2～3 d。

1.2.1.2

菌株的筛选。观察菌落生长情况，依据菌落的生物特征、气生菌丝等特点筛去重复菌株。将筛选的单菌落挑取至含色氨酸的R2A液体培养基中，置于30 ℃ 200 r/min摇床上振荡培养24 h。

（1）细菌溶磷能力的筛选。振荡培养后分别吸取1 μL孢子悬浮液，点接在蒙金娜无机磷平板中央，于34 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h。观察菌落周围是否出现溶磷圈，溶磷圈越大，则该菌株溶磷效果越强。

（2）细菌产IAA（吲哚乙酸）能力的筛选。将待测菌株在含有色氨酸的液体LB培养基中培养7 d后，取上清液离心10 min，将离心后的上清液与Salksowski比色液在96孔板上1∶1混合进行显色反应，将96孔板置于38 ℃条件下避光保温40 min，观察颜色变化，颜色越深说明该菌株产IAA的能力越强。

将筛选出的既有产IAA能力又有溶磷效果的菌株，采用平板划线法进行纯化，并保存在甘油中，放置在-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌株生理生化鉴定。

采用平板划线法将菌株S1在LB培养基上培养出单菌落，观察菌落颜色、形态及菌体的形态，并采用细菌微量生化鉴定管对菌株S1进行生理生化鉴定试验。

1.2.3 菌株分子水平鉴定。

1.2.3.1 总DNA提取及PCR扩增。

使用细菌全基因组DNA提取试剂盒及细菌通用引物提取S1菌株的总DNA。

1.2.3.2 PCR产物检测、纯化与测序。

用移液枪取5 μL扩增后的PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混匀，加样于凝胶样孔中进行电泳。约30 min后，将电泳好的凝胶取出放置在紫外透射仪下进行检测，在约1 300 bp处看到1条亮带，说明扩增成功。将扩增后的序列送至擎科科技有限公司测序。

将测序得到的结果输入NCBI数据库进行BLAST比对，选取相似度最高的一些种属并下载其16S rRNA基因序列，利用这些序列在MEGA 7.0软件中构建系统发育树。

1.2.4 菌株发酵液的制备及计数。

将菌株接种在LB固体培养基上，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养，培养1 d后，接种于LB液体培养基中，28 ℃ 220 r/min 振荡培养1 d，然后在离心机中28 ℃ 6 000 r/min离心6 min，得到的上清液即为细菌发酵液。

用梯度稀释法将细菌发酵液浓度依次调节至1×10-9 CFU/mL，每个浓度吸取100 μL细菌发酵液，依次滴加在LB固体培养皿上均匀涂布，用无菌涂布棒均匀涂布至干燥，每处理设置3个重复。将完成涂布分离的平板倒置在28 ℃ 培养箱中培养1 d，找出在培养皿上长出10～100菌落数的处理，计数并求平均值。

1.2.5 菌株对番茄种子萌发的影响。

用无菌水将番茄种子洗净并浸泡4 h，控干水分后，用0.4%高锰酸钾浸泡10 min，之后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分。取5个50 mL无菌离心管，每个离心管放入50粒处理后的番茄种子，将已过滤的浓度为1×107 CFU/mL菌株发酵液按10、100、500、1 000、2 000倍稀释后分别得到浓度为1×106、1×105、2×104、1×104、5×103 CFU/mL的发酵液，以添加相同体积、稀释倍数相同的LB液体培养基和无菌水浸泡作为对照组，每处理重复3次。将各处理放置在25 ℃、相对湿度为90％的光照培养箱中，设置光照为12 h/d。为确保种子湿润，每天定期喷少量无菌水。以发芽试验当天记作0 d，8 d后统计发芽势，10 d后计算发芽率，利用公式计算发芽指数和活力指数［16］。