烟梗中木质素的分子量分析

摘要 ［目的］建立烟梗中木质素分子量的分析方法，为评价烟梗品质以及优化加工工艺提供参考方法。［方法］从烟梗中分离、提取得到木质素，经DMAC高温活化后，选用LiCl/DMAC溶剂体系进行溶解，通过优化凝胶渗透色谱（GPC）条件后进行分析。［结果］优化后GPC分析条件为样品浓度2.0 mg/mL、柱温60 ℃、流速0.8 mL/min，流动相为0.5%（w∶v）LiCl/DMAC溶剂；在优化的GPC条件下，利用标准品PS对系统校正，测得的烟梗木质素的分子量为103～104 Da，重均分子量（Mw）为8 064 Da。［结论］根据该研究中建立的方法，利用LiCl/DMAC溶剂体系，可以解决烟梗中木质素的结构复杂、难溶解造成分子量不易测定的问题，因此利用LiCl/DMAC溶剂体系能有效地测定烟梗中木质素的分子量。

关键词 烟梗；木质素；分子量；凝胶渗透色谱；LiCl/DMAC溶剂

中图分类号 TS 42  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）20-0180-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.20.047

Analysis of the Molecular Weight of Lignin in Tobacco Stem

SUN Rui-qi1，REN Meng-meng1， XIONG Jun-wei2 et al

（1.College of Food Science ＆ Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083;2.Technology Center of Shanghai Tobacco Group Co.，Ltd.，Shanghai 201315）

Abstract ［Objective］To establish an analytical method for the molecular weight of lignin in tobacco stems，and provide a reference method for evaluating tobacco stem quality and optimizing processing technology. ［Method］The lignin was separated and extracted from tobacco stems. After being activated by DMAC at high temperature， the LiCl/DMAC solvent system was selected for dissolution， and the gel permeation chromatography （GPC） conditions were optimized for analysis. ［Result］The optimized GPC analysis conditions were：sample concentration was 2.0 mg/mL， column temperature was 60 ℃， flow rate was 0.8 mL/min，mobile phase was 0.5% （w∶v） LiCl/DMAC solvent; under optimized GPC conditions，using standard PS to calibrate the system， the measured molecular weight of tobacco stem lignin was 103-104 Da， and the weight average molecular weight （Mw） was 8 064 Da.［Conclusion］According to the method established in the article， the use of LiCl/DMAC solvent system can solve the problem that the structure of lignin in tobacco stems is complex and difficult to dissolve， which makes it difficult to determine the molecular weight. Therefore， the use of LiCl/DMAC solvent system can effectively determine the molecular weight of lignin in tobacco stems.

Key words Tobacco stem;Lignin;Molecular weight;Gel permeation chromatography （GPC）;LiCl/DMAC solvent

烟草是一年生草本植物，属茄科（Solanaceas）烟草属（Nicotiana）。烟梗即烟草叶片的粗硬叶脉，占整个烟叶重量的25%左右［1］，作为烟叶的一部分，主要起支撑叶片的作用。烟梗中木质素的平均含量约为8%，其分子聚合度较大，燃烧热裂解性能较差［2］，热裂解后会产生苯酚、邻苯二酚、烷基儿茶酚等物质，这些酚类化合物不仅会引起涩口，而且对健康有害［3］。烟梗中木质素的聚合度及分子量是影响木质素高温条件下裂解的重要因素［4］，会影响燃吸品质，因此，除了研究木质素的含量，还需要分析木质素分子量的大小，才能够有效地评价烟梗的品质。

目前用来测定分子量分布的方法主要有质谱法、凝胶渗透色谱法、光散射法、蒸汽压渗透法、超滤法等。其中凝胶渗透色谱（GPC）法是目前分子量测定最常用的方法，其分离原理是基于分子体积大小不同而对不同分子量的样品进行分离和测定［5-7］。但由于烟梗中木质素分子的溶解度较差，影响分子量的准确测定。目前常用四氢呋喃 （THF） 作为溶剂溶解木质素，但木质素在溶解前需要进行烦琐的提取及衍生化处理以提高溶解性。衍生化的方法有乙酰化、甲基化、硅烷化等［8］，但这些方法操作复杂，溶解性改善有限，导致测定误差较大［9］，应用受到限制。LiCl/DMAC（氯化锂/二甲基乙酰胺）体系中，LiCl溶解在DMAC中形成大阳离子［Li（DMAC）］+和游离的Cl-，这样能够有效地打开原晶区的氢键网络，使氢键等相互作用发生断裂，分子链变得较为松弛，易溶于溶剂中［10-12］，更容易与紧密排列的结晶区接触，增加大分子的溶解度［13-15］。因此，该研究利用LiCl/DMAC溶剂体系活化木质素分子，对木质素的分子量及其分布进行研究。

1 材料与方法

1.1 试材 烤烟烟梗（湖南短梗）。

超纯水（去离子水经过Milli-Q超纯水仪制的，18.2 MΩ·cm）；二甲基乙酰胺（DMAC）、无水氯化锂（色谱级，北京百灵威科技有限公司）；吡啶（分析纯，北京百灵威科技有限公司）；α-淀粉酶、糖化酶（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；脱碱木质素（分析纯，北京百灵威科技有限公司）。

1.2 仪器

Agilent 1260凝胶渗透色谱仪（配置示差折光检测器、光散射检测器，安捷伦科技有限公司）；GPC分离柱［重均分子量（Mw）200～3 000 000 Da，PLgel MIXED-C  5 μm，7.5 mm×300 mm，安捷伦科技有限公司］;万分之一天平（BS200S-WEI，德国Sartorius公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 烟梗样品前处理。

1.3.1.1 去除脂溶性物质。

烟梗经冷冻干燥除去水分，经高速粉碎机打碎呈粉末状，过60目筛；称取1.0 g左右的粉状样品，加入25 mL乙酸乙酯超声30 min，离心（4 000 r/min，5 min），所得沉淀物再利用上述方法第二次超声处理。

1.3.1.2 乙醇超声提取去除可溶性糖、色素及酚类物质等。

向“1.3.1.1”沉淀中加入25 mL 的85%乙醇超声30 min（2遍），离心（4 000 r/min，5 min），滤渣用冷水反复洗涤，向上清液中加入DNS试剂，沸水浴共热5 min后，根据是否显色判断滤渣中可溶性糖是否去除完全。

1.3.1.3 α-淀粉酶、糖化酶酶解去除淀粉大分子物质。向“1.3.1.2”滤渣中加入40 mL pH=6的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液及2 000 U/g的α-淀粉酶，60 ℃恒温水浴水解2.5 h；之后加入40 mL pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液及10 000 U/g的糖化酶，60 ℃恒温水浴水解1.5 h，离心（4 000 r/min，5 min），滤渣用冷水反复洗涤。

1.3.1.4 纤维素酶、果胶酶、蛋白酶酶解去除纤维素、果胶、蛋白质等大分子物质。向“1.3.1.3”滤渣中加入40 mL pH=4.7的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，分别加入纤维素酶、果胶酶、蛋白酶（用量分别为150、5 000、5 000 U/g），摇匀后置于恒温振荡培养箱中，在45 ℃（90 r/min）条件下酶解10 h；酶解后，将酶解液离心（4 000 r/min，5 min），滤渣用冷水反复洗涤。

1.3.2 烟梗中木质素的提取。

向“1.3.1.4”滤渣中加入25 mL NaOH/尿素溶液，其中NaOH的质量分数是8%，尿素的质量分数是12%；在-10 ℃下搅拌30 min，然后离心分离，得到下层滤渣。向滤渣中加入20 mL质量分数为17.5%的硫酸溶液，在100 ℃下搅拌反应30 min，离心分离，得到上层清液和下层滤渣。用纯水洗涤下层滤渣至中性，再用丙酮洗涤3次，然后放在50 ℃的烘箱中干燥20 min；再加入25 mL NaOH/尿素溶液，其中NaOH的质量分数是8%，尿素的质量分数是12%；在-10 ℃下搅拌30 min，然后离心分离，将滤渣进行冷冻干燥，即得到提取的烟梗木质素。

1.3.3 烟梗木质素的活化。称取50 mg提取的木质素于玻璃瓶中，加入10 mL的DMAC溶液，在150 ℃油浴中加热2 h活化木质素，离心后得到滤渣。

1.3.4 烟梗木质素的溶解。

加入适量的无水LiCl在10 mL DMAC中，使得LiCl浓度为8%（w/v），待LiCl完全溶解后，加至活化后的木质素滤渣中，100 ℃加热搅拌2 h，降温至50 ℃，搅拌24 h，室温放置一段时间后，用DMAC稀释定容至 25 mL 容量瓶中，待用。

1.3.5 烟梗木质素分子量的测定。

1.3.5.1 溶液配制。

（1）样品溶液。分别称取25、50 mg提取的木质素，按照“1.3.3”和“1.3.4”方法将其活化、溶解，定容至25 mL容量瓶中，制得浓度为1.0、2.0 mg/mL的样品溶液，备用。

（2）流动相。称取一定量的无水LiCl加至DMAC溶液中配制成0.5%（w/v）LiCl/DMAC溶液，待其完全溶解后，使用溶剂过滤器过滤3次，滤膜采用0.22 μm的有机膜，每次过滤均需重新更换滤膜。

（3）标准品溶液。因聚苯乙烯（PS）含有苯环，结构与木质素更相近，所以选择PS作为标准品。准确称取0.020 0 g的PS标准品，加入流动相使其完全溶解，将其定容至10 mL容量瓶中，摇匀，制得2.0 mg/mL的标准品溶液。

1.3.5.2 凝胶渗透色谱分析（GPC检测）。分别将“1.3.5.1”样品溶液及标准品溶液用0.45 μm的有机膜过滤，之后进行GPC分析。标准品聚乙烯的比折光指数增量（dn/dc）为0.152，重均分子量（Mw）为114 200 Da，相对于水的折光率为0.041。GPC检测条件：流动相0.5%（w/v）LiCl/DMAC溶液，进样量50 μL，样品浓度2.0 mg/mL，激光相对能量（LS）100%，柱温60 ℃，示差折光检测器（RI）温度40 ℃，流速0.8 mL/min，分析时间20 min。

2 结果与分析

2.1 烟梗木质素GPC分析条件的优化

2.1.1 样品浓度的优化。

在其他条件不变的情况下（流速0.8 mL/min、柱温60 ℃、LS 100%），按照“1.3.5”方法，考察不同样品浓度（1.0、2.0 mg/mL）对GPC分析的影响，结果如图1所示。