3种甘薯病毒多重PCR检测方法的建立与应用

摘要  针对甘薯卷叶病毒（SPLCV）、甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）的外壳蛋白（CP）基因序列，设计了3种病毒的3对特异性引物，扩增大小分别为180、295、774 bp，通过对引物添加量、退火温度、循环数等反应条件的优化，完善了能同时扩增出SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒的多重PCR体系，可以实现同时对甘薯3种病毒104拷贝水平的检测，并具有良好的特异性。利用该技术体系，对不同田间样品进行了检测，PCR产物测序表明，3种病毒序列与已知的参考序列同源率一致性分别达到94%、94%、97%及以上。建立能够同时进行3种病毒检测的多重PCR检测技术体系，可以快速准确地进行甘薯脱毒苗病毒检测和田间样品的诊断。

关键词  甘薯；甘薯卷叶病毒（SPLCV）；甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）；甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）；多重PCR

中图分类号  S 435.313文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2022）22-0089-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2022.22.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment and Application of Multiplex PCR for Detection of Three Viruses in Sweet Potato

LI Wen-zong，LIANG Xin，YANG Lu-lu et al

（Henan Huazhi Nutrition Technology Co.，Ltd.，Xinxiang，Henan  453000）

Abstract  Three pairs of specific primers for sweet potato leaf curl virus （SPLCV），sweet potato feathery mottle virus （SPFMV） and sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV） were designed based on conserved region sequences of the coat protein （CP） genes published in NCBI.The amplification size was 180，295 and 774 bp respectively.By optimizing the reaction conditions such as primer addition amount，annealing temperature and number of cycles，the multiplex PCR system that could simultaneously amplify three viruses，namely，SPLCV，SPFMV and SPCSV were improved.It could simultaneously detect 104 copy levels of three sweet potato viruses，and had good specificity.Using this method to detect field samples，the compound infected virus could be detected accurately.Sequence analysis showed that the sequence homology of the target fragments were 98%，94% and 97% respectively.The results showed that the establishment of a multiplex PCR detection technology system capable of simultaneously detecting three viruses could rapidly and accurately conduct virus detection of sweet potato virus-free seedlings and diagnosis of field samples.

Key words  Sweet potato;Sweet potato leaf curl virus （SPLCV）;Sweet potato feathery mottle virus（SPFMV）;Sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV）;Multiplex PCR

甘薯病毒病是甘薯的重要病害，具有种类繁多、分布广泛、容易传播、危害严重、防控困难等特点。甘薯是无性繁殖作物，在感染病毒后，在甘薯体内病毒会不断积累，逐代加重，进而引起甘薯产量和品质的下降以及种性的退化，严重损害甘薯产业的健康发展［1］，是目前限制甘薯生产的主要因素之一。已知侵染甘薯的病毒有30余种［2-3］。甘薯卷叶病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV）、甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）是3种严重危害甘薯的病毒，在世界甘薯种植区广泛分布［4-6］。其中，SPLCV为单链环状DNA病毒，基因组大小约2.8 kb，是双生病毒科菜豆金色花叶病毒属成员［7］；SPFMV为正义单链RNA病毒，基因组大小约10 kb，是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属成员;SPCSV为双组份正义单链RNA病毒，基因组大小约15.3～16.0 kb，是长线形病毒科毛行病毒属成员［8］。不同品种甘薯植株在遭受SPLCV病毒侵染后，会表现出不同程度的致病症状，如叶片向上卷曲、黄化等，此外其叶绿素含量指数、叶面积、叶片鲜重均有所降低［9］。SPFMV和SPCSV可以协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害（sweet potato virus disease，SPVD）［10］，甘薯植株在单独受到SFMV或SPCSV后的症状表现轻微，而受SPVD感染的甘薯植株表现出明显的矮化、叶片褪绿、花叶明脉等症状［11］。SPVD的发生能够显著影响甘薯的产量，在SPVD发生严重时，可使甘薯的产量损失达到90%以上，甚至绝收，其原因在于甘薯植株在感染SPVD病毒后，其叶片叶绿素含量降低导致光合速率下降，进而影响甘薯的产量［12-14］。有研究表明，SPFMV在我国不同甘薯产区普遍存在，而种薯是否携带SPCSV则是苗期甘薯病毒病发生的关键因素［4，15-16］。因此，推广和应用甘薯脱毒种苗，可以有效地防止病毒病造成的危害。

病毒检测是脱毒苗生产和田间苗病毒鉴定的重要环节之一，甘薯病毒病常用的检测方法有症状学诊断法、指示植物检测法（生物学检测法）、血清学检测法、分子生物学检测法等。以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为代表的分子生物学检测技术正逐步成为病毒检测的主要方法。PCR技术的应用弥补了症状学诊断法、指示植物检测法、血清学检测法的不足，如准确性低，检测周期长，假阳性反应率高等。常规PCR技术检测一次只能检测一种病毒，对于复合侵染的病毒需要进行多次PCR反应，操作较为烦琐。而多重PCR是在普通的单一PCR基础上发展起来的，可以同时扩增多个基因，具有灵敏、快速、高效、成本低、特异性强、步骤简便等特点，适合进行大量甘薯样品的检测［17］。目前关于应用多重PCR对2种及以上的甘薯病毒的检测已有相关研究［18-21］，但对于SPLCV、SPFMV和SPCSV 3种病毒的多重RT-PCR检测鲜见相关报道。建立针对以上3种常见甘薯病毒的多重PCR检测技术具有广阔的应用前景。笔者以单一PCR为基础，全面优化多重PCR反应体系，建立了以上3种常见甘薯病毒的多重PCR检测体系，以期为甘薯病毒检测提供一种简便、快捷的分子生物学方法，为甘薯田间病毒鉴定和甘薯脱毒苗的生产提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

材料：供试甘薯样本为采自河南新乡的带有明显病毒症状的甘薯田间样本；将经过检测不含SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒的甘薯脱毒组培苗作为阴性对照。

试剂：植物DNA提取试剂盒、植物总RNA提取试剂盒购自百奥曼公司，反转录试剂盒、2×Taq Mix Pro（+Dye） 购自莫纳生物公司，SPLCV病毒重组质粒（含SPLCV CP基因）、SPFMV病毒重组质粒（含SPFMV CP基因）、SPCSV病毒重组质粒（含SPCSV CP基因）由河南华智营养科技有限公司构建保存，其他所应用的试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成。

根据NCBI数据库中收录的SPLCV、SPFMV和SPCSV［21］外壳蛋白（CP）基因的核苷酸保守序列和文献分别设计和合成引物。引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.2 核酸的提取。

称取约100 mg的甘薯叶片，经液氮研磨后按照植物总RNA提取试剂盒和植物总DNA提取试剂盒说明书分别提取甘薯叶片RNA和DNA。利用琼脂糖凝胶电泳分别检测RNA和DNA的提取质量。

1.2.3 单一PCR反应体系和条件。

采用MonScriptTM RTⅢ Super Mix with dsDNase （Two-step）的说明书进行反转录试验，获取待测样品的第1链cDNA，并以获取的高质量DNA或cDNA作为模板，分别对3种病毒进行特异性扩增检测。单一PCR反应体系：2×Taq Mix Pro（+Dye） 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板或cDNA模板各1.0 μL，无菌水补足至20 μL。具体反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循环数为35；72 ℃最终延伸10 min。

待PCR扩增反应结束后，取5 μL扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后，采用凝胶成像仪进行结果分析和记录。

1.2.4 多重PCR检测反应条件的优化和建立。

以SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒基因组混合质粒作为模板，参考单一PCR反应体系，加入以上3种病毒的特异性引物进行多重PCR反应，对能够影响多重PCR的几个主要条件（引物添加量、退火温度、循环数）依次进行优化，在进行某一个条件的优化时，应保持其他反应条件不变。

引物SPLCV-F/R ∶SPFMV-F/R ∶SPCSV-F/R的使用量比例设置5个处理：0.5 μL/0.5 μL ∶0.5 μL/0.5 μL ∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL ∶0.5 μL/0.5 μL ∶0.2 μL/0.2 μL；0.1 μL/0.1 μL ∶0.2 μL/0.2 μL ∶0.5 μL/0.5 μL；0.2 μL/0.2 μL ∶0.2 μL/0.2 μL ∶0.5 μL/0.5 μL；0.4 μL/0.4 μL ∶0.2 μL/0.2 μL ∶0.5 μL/0.5 μL。

循环数分别设25、30、35、40次；退火温度分别设48、52、56、 58、62 ℃。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 多重PCR的特异性检测。

分别以构建完成的SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒基因组质粒作为模板，应用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，根据阿伏伽德罗常数将浓度换算为拷贝数。以浓度分别为107拷贝/μL的SPLCV、SPFMV、SPCSV病毒基因组重组质粒当作模板，进行多重PCR，检测反应体系的特异性。同时，利用经检测不含有甘薯病毒的组培苗样品测试多重PCR体系的特异性。

1.2.6 多重PCR的灵敏性检测。

将SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒的基因组重组质粒混合，随后进行10倍稀释，选取浓度为106、105、104、103、102拷贝/μL 5个浓度梯度的3种病毒混合质粒作为检测模板，进行多重PCR检测，以进行多重PCR的灵敏性检测。

1.2.7 多重PCR的初步应用。

从新乡市郊区采集带有相应病毒症状的甘薯田间样本，利用建立的多重PCR体系进行检测。

1.2.8 PCR产物的测序与序列分析。