基因工程中PCR技术常考知识点的归纳与拓展

［摘 要］PCR技术是基因工程中获取和扩增目的基因的常用方法之一，其中常考查到的知识点有与引物相关的问题、酶切片段分析及变性、复性、延伸等环节的相关分析等。文章结合典型考题对这几个问题进行归纳分析。

［关键词］基因工程；PCR技术；常考知识点

［中图分类号］    G633.91        ［文献标识码］    A        ［文章编号］    1674-6058（2024）14-0080-04

【名师简介】曾凡洪，中学高级教师，武汉市学科带头人，曾担任高中生物奥赛主教练。先后在《生物学教学》《中学生物教学》《中学教学参考》《高中生学习》等报纸杂志上发表文章50余篇，并参与多本著作的编写。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大后进行比对，这也是“微量证据”的威力之所在。PCR的理论依据是DNA复制，一般的中学实验室很难具备相应的实验设备和操作条件，因此对于这块知识，基本上是以理论讲解为主。目前的一些考题涉及的PCR知识已经比较具体和深入了，具有一定的难度。本文结合典型考题对基因工程中PCR技术常考知识点进行归纳分析。

一、与引物相关的问题

引物是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点。在引物的3＇—OH上，核苷酸以酯键形式进行加成，因此引物的3＇—OH必须是游离的。引物分为两种：存在于自然生物的DNA复制引物（RNA引物）和PCR中人工合成的引物（通常为DNA引物）。一般所说的引物是指DNA引物。PCR中的引物是人工合成的两段寡脱氧核苷酸序列。

（一）设计引物的基本要求

根据DNA复制原理和引物的作用，在设计引物时，要注意以下几个基本问题。

1. 引物自身不应存在互补序列

若引物自身存在互补序列，引物自身就会折叠成发卡结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。一般要求引物自身不能有连续4个碱基的互补。

2.引物与引物之间不应存在互补序列

两个引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3＇端的互补重叠，以防止引物二聚体的形成。一般要求引物之间不能有连续4个碱基的互补。

3.引物中G+C碱基应占一定的比例

G+C碱基含量尽量控制在40%到60%之间，解链温度（Tm值）最好贴近72 ℃，G+C碱基含量太低会导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于增强PCR的特异性；G+C碱基含量太高也易于引发非特异扩增。

4. 一对引物中G+C碱基占比最好基本相等

一对引物中G+C碱基占比基本相等可防止引物对在退火、延伸等环节反应差别太大。

（二）带有一个引物和带有一对引物的比例问题（放射性DNA含量的比例分析）

在设计引物时，若用放射性同位素标记，则产物中也会出现放射性，分为一条链带有放射性和两条链带有放射性两种情况，对应的是产物带有一个引物和带有一对引物。

（三）两条链等长的DNA分子最先出现在第几轮循环及所占的比例问题

引物结合到模板链上时，一般会从模板链的3＇端靠近内侧段结合上去，导致刚扩增产生的DNA分子两条链不等长。随着扩增轮数的增加，会逐渐出现两条链等长的DNA分子，且其比例会逐渐增加。

【典例1】（2011·江苏，第33题节选）请回答基因工程方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图1所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为                     。

②在第              轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

图1

解析：PCR扩增（或DNA复制）时，一对引物分别结合到两条模板链上，根据半保留复制的特点，只有1个DNA分子不含有引物A（含引物B），经过四轮循环，产生24（16）个DNA分子，含有引物A的DNA片段有15个。

DNA分子复制时，每次只有用上一轮新形成的DNA单链为模板，所合成的DNA分子的长度才会逐渐缩短，直到出现两条链等长的DNA分子为止。因此，可以用图2来表示DNA复制的轮数与DNA分子长度之间的关系：从上往下，上面的一条链是模板链，下面的一条链是新合成的子链，下一轮复制时始终是以下面这条链为模板所形成的DNA分子才是最短的，则经过第三轮复制后，出现了两条链等长的DNA分子。且以一条链为模板时，到第三轮就会出现1个两条链等长的DNA分子，因此，一个DNA分子经过第三轮循环后就会出现2个两条链等长的DNA分子，所占的比例为2/23=1/4。

图2

答案：15/16    三

（四）需要的引物数与循环次数之间的关系

PCR扩增过程中，循环了n次，则得到的DNA分子数为2n，脱氧核苷酸链数为2×2n，其中只有2条模板链不带有引物，则循环n次时，所需要的引物数为2×2n-2。

（五）引物末端修饰问题

在基因工程中，有时为方便构建重组质粒，在引物中需要增加恰当的限制酶切点，或为了显示目的基因所在位置、产生定向变异等，需要对引物进行适当的修饰。引物的5＇端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性；而引物的延伸是从3＇端开始的，该端不能进行任何修饰。引物的5＇端修饰包括加酶切位点、加标记荧光、引入蛋白质结合DNA序列、引入点突变、插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列等。

【典例2】（2021·山东，第25题节选）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后， γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图3所示。

图3

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图3可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是               ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是               。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要               种酶。

解析：此题具有一定的难度，首先应读懂题意。要在荧光蛋白基因前面插入γ基因上游不同长度的片段，并能使荧光蛋白表达，只能分别用MunⅠ和XhoⅠ来对荧光蛋白基因的前面部位进行切割，且根据F1～F7片段表达的方向（左→右）和荧光蛋白基因表达的方向（右→左），只能F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶与XhoⅠ产生的黏性末端相同，R末端添加的序列所对应的限制酶与MunⅠ产生的黏性末端相同，再根据图3中提供的五种限制酶识别序列及切割位点可知，与XhoⅠ产生相同的黏性末端的限制酶只能是[SalⅠ，]与MunⅠ产生相同的黏性末端的限制酶只能是EcoRⅠ。从产物扩增到载体构建完成的整个过程需要Taq DNA聚合酶、限制酶[SalⅠ、][EcoRⅠ、][XhoⅠ、][MunⅠ、]DNA连接酶共6种酶参与。

答案：SalⅠ EcoRⅠ 6

（六）引物结合位置的确定问题

为了获得符合要求的PCR产物，不仅要求引物设计合理，还应考虑引物与模板链的结合部位的恰当性。

【典例3】（2020·江苏，第33题节选）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图4（以EcoRⅠ酶切为例）：

图4

请据图回答问题：

（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是                          （从引物①②③④中选择，填编号）。

[      DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）  已知

序列       [5＇-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3＇][3＇-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5＇]      PCR

引物       ①5＇-AACTATGCGCTCATGA-3＇

②5＇-GCAATGCGTAGCCTCT-3＇

③5＇-AGAGGCTACGCATTGC-3＇

④5＇-TCATGAGCGCATAGTT-3＇    ]

解析：此题难度较大，根据碱基互补配对原则，引物①②③④结合到已知序列上的位置及延伸方向如下表所示（“→”方向表示延伸方向）：

[      DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）  已知

序列                                             ←④                                            ←③