高中生物学PCR技术中的引物设计

［摘 要］聚合酶链式反应（PCR）是江苏高考生物试题中的常考内容，PCR技术的用途并不局限于最初、最基本的获取目的基因。PCR技术的使用场景极其灵活，通过引物设计，可以达到融合基因、定点诱变等效果。文章对PCR技术中的引物设计思路进行分类，介绍其衍生的各种应用，为教师教学提供参考。

［关键词］PCR；引物设计；高中生物学

［中图分类号］    G633.91        ［文献标识码］    A        ［文章编号］    1674-6058（2024）14-0084-04

核心素养是高考命题和各类考试命题的指导方向和原则。为加深学生对基因工程大概念的理解，提升学生的生物学科核心素养，《普通高中生物学课程标准（2017年版2020年修订）》要求教师在基因工程的教学过程中开展“利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验”活动［1］。引物直接决定PCR的特异性与成功与否。人教版高中生物学选择性必修三中通过图片简单演示了PCR的基本过程，并未涉及引物设计，而近几年各地的高考试题为了响应新课标要求，基于核酸检测、DNA测序等真实情境，增加了许多与引物设计相关的技术困境内容。为跨越教材与实际应用的鸿沟，笔者对不同应用场景中的引物设计进行分析，以促进学生对PCR的理解，为教师教学提供参考。

一、以基因定位为目的的反向引物设计

以真核生物为受体细胞时，目的基因一般需整合至受体细胞的染色体DNA中，以实现稳定存在与表达。在上述情境中，为进行目的基因定位，需要在已知目的基因的附近逐步搜索并测序相邻的DNA区域，这就需要用到反向PCR。

［例1］农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的DNA中。研究者将图1中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是（ ）。

图 1

A.PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理

B.进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶

C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列

D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置

解析：对含目的基因的T-DNA中两侧未知序列通过同种限制酶或是同尾酶进行酶切（目的基因中不能存在该酶的酶切位点），可取得相同的黏性末端。通过DNA连接酶令图 1含T-DNA的片段自身环化［2］成图2甲的环形DNA分子。

碍于DNA聚合酶的特性，子链总是从5＇端往3＇端延伸。若目的为扩增T-DNA，应选择指向已知扩增片段的内侧的引物②、③。选择引物①、④，子链向外侧未知序列进行延伸。由于PCR体系中没有DNA连接酶，因此子代DNA仍是线性（如图2乙）。扩增后，原本在两侧的未知序列被转移到已知序列的内部（如图2丙）。随后，我们可以对未知序列进行测序，比对受体细胞的基因组文库，即可确定T-DNA插入的位置。

图 2

参考答案：C

二、鉴定目的基因连接方式的反向引物设计

构建基因表达载体时，若使用单酶切可能出现目的基因的反向连接。目的基因的筛选与检测是基因工程的重要环节，可以通过设计引物进行PCR，筛选目的基因与载体的正向连接产物。

［例2］为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图3所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置。

（1）PCR鉴定时应选择的一对引物是              。

（2）某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是                                                                                               。

解析：如图 4所示，黑色区域为目的基因，我们在目的基因内、外各设计一引物，图中为正向连接时各引物序列的位置。使用引物1、引物3可扩增出对应片段，当目的基因反向连接时，引物1与引物3方向相同，无法有效扩增。同理，选择引物2、引物4，也可以进行上述验证。与预期相符的DNA长度就可以用于确认目的基因的正向连接。

图3为正向连接时的引物分布。引物丙、引物甲位于目的基因的上游和下游，无论连接方向是否正确，均可扩增出片段且长度相同，无法作为排除的依据。

若使用引物丙、引物乙进行PCR，考虑反向连接时，引物乙的方向与引物丙相同，无法扩增片段，正向连接时引物丙、引物乙可以扩增出350 bp长度的片段。

同理，若选择引物甲、引物乙进行PCR，反向连接时能扩增出400 bp片段，正向连接时无扩增产物，但空质粒也会带来相同的结果，无法确定实现了正向连接。

因此，PCR鉴定时应选择引物乙、引物丙。学生扩增出400 bp片段的原因是目的基因反向连接。

参考答案：（1）乙、丙 （2）目的基因反向连接

三、PCR体系中的引物序列改造

目的基因想要导入表达载体，两侧需要有合适的酶切位点。实验室用到的限制酶价格高昂，种类有限，为了不被基因自身序列限制，就需要对引物序列进行改造。引物设计的依据是目的基因的两侧序列，但这并不意味着引物需要与模板完全互补。我们既可以在5＇端进行添加限制酶识别序列，也可以在中间进行少量碱基的增删或者替换。引物改造的部分序列不能和原对应模板配对，但不影响引物和模板的整体配对，因此，其扩增产物的对应位置就会引入识别序列，或是发生碱基对的增删或者替换［3］。

（一）引入序列与连接DNA

引物与模板的结合并不需要完全一一对应。引物的3＇端是DNA聚合酶添加游离脱氧核苷酸的位点，如果引入的核苷酸序列添加在3＇端，会导致扩增产物的特异性下降。因此，我们常常只在5＇端添加所需要的酶切位点。若在两个DNA片段对应引物的5＇端分别构建相同或者互补序列，对获得的新DNA进行变性与杂交，还可以达到连接DNA的效果。

［例3］科研人员通过敲除里氏木霉基因组中去乙酰化酶基因（HDAC），探究组蛋白乙酰化对纤维素酶基因表达的影响，其主要过程如图5。请据图回答：引物设计是PCR的关键，本研究中引物R1的5＇端添加与引物FG互补的序列，其目的是                     。在PCR5中加入的引物是                       。

图 5

解析：通过PCR1、PCR2，可获得新霉素抗性基因GR与H1的构造（如图 6）。

图 6

以GR 基因、H1为模板，F1和RG为引物进行PCR4扩增，在高温作用下双链会打开。由题可知，引物R1的5＇端添加了与引物FG互补的序列，因此其延伸产物H1基因的b链5＇端也存在引物FG的互补序列，b链与c链就能够部分配对（如图 7）。Taq  DNA聚合酶只能从5＇端向3＇端延伸，这两条链的3＇端都缺乏模板，无法继续延伸。

图 7

a链的3＇端与R1序列互补，d链的3＇端与FG互补。由于R1与FG互补，因此a链的3＇端和d链的3＇端也是互补的（如图 8）。

图 8

在Taq  DNA聚合酶的作用下，可将重叠的两条链补齐（如图9）。

图 9

两个基因就这样融合成功。随后a链、d链分别结合引物RG、F1进行PCR4，就得到了大量的H1-GR融合基因。这种借助引入序列连接DNA的方法我们称为重叠延伸PCR。按照相同的逻辑，可以将基因H2和GR也进行连接。

图10

如图10，通过类比，不难想到应令c链和f链发生互补配对、延伸。随后c链、f链分别以R2、FG为对应引物，进行大量扩增。为确保这两条链的碱基互补配对，可在F2的5＇端通过引入序列，添加与RG互补的序列。

综上，本研究中在引物R1的5＇端添加与引物FG互补的序列，其目的是便于PCR4时H1和GR基因的连接。在PCR5中加入的引物是R2和FG。

参考答案：便于H1和GR的拼接 R2和FG

（二）定点诱变

引物是PCR产物5＇端的一部分，引物长度一般为15～27 bp，因此最初建立的PCR定点诱变技术只适用于DNA的末端突变。突变位点在基因中部时，我们就得设计两对引物，基因中部的两个诱变引物分别与两侧常规引物将目的基因分段扩增，再以上文中连接DNA的方式将两段诱变DNA融合。

［例4］重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图11。下列说法错误的是（ ）。

图11

A. 过程②需要含Mg2+的缓冲液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等

B. 若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生3种DNA分子

C. 经过过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过过程⑤获得目的基因

D. 过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，需要引物

解析：过程④获得的杂交DNA具有游离的3＇端，也具有模板，可以直接使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物。其连接机制与例3相同。