穿心莲内酯对胃癌细胞铁死亡的影响

摘要：目的 探讨穿心莲内酯对胃癌细胞铁死亡的影响及作用机制。方法 将胃癌细胞株AGS分为阴性对照两组（NC两组）和穿心莲内酯处理两组（AG两组），分别用含0 μm、20 μm AG的DMSO处理细胞24 h。通过CCK-8检测分析药物对细胞活力的影响，通过Fe2+检测法、丙二醛测定、还原型谷胱甘肽和活性氧检测评估胃癌细胞铁死亡水平。通过蛋白质免疫印迹实验评估胃癌细胞铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11表达水平。 结果 经过AG处理后，胃癌细胞活力明显下降，Fe2+、MDA和ROS水平明显升高，GSH含量明显降低，GPX4和SCL7A11表达水平明显下降（P＜0.05）。结论 穿心莲内酯可通过影响铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11表达诱导胃癌细胞铁死亡的发生。

关键词：穿心莲内酯；胃癌；铁死亡；GPX4；SLC7A11

胃癌（gastric cancer）是常见的恶性肿瘤之一[1]。胃癌的发病机制尚不清楚，但普遍认为幽门螺旋杆菌感染、吸烟、高盐饮食、饮酒等是主要的危险因素。目前手术是胃癌主要的治疗手段，联合应用放疗、化疗及靶向治疗效果更佳。因此，研究分子机制途径，开发新的胃癌治疗用药对提高胃癌生存获益至关重要。铁死亡（ferroptosis）是一种新的非凋亡细胞死亡模式，是多种途径导致细胞内氧化还原稳态失衡的结果[2]。铁死亡的基本特征包括：谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性丧失，导致脂质过氧化修复机制缺陷，引起脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累积。越来越多的研究报道了铁死亡与胃癌之间的相关性，如胃癌细胞铁死亡水平降低导致的肿瘤耐药性[3]。穿心莲内酯（andrographolide，AG）是从天然植物穿心莲中萃取的二萜类内酯活性化合物。研究表明，AG具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤和调节免疫等功能，而AG的抗肿瘤功能更是近年来的研究热点[4]。本研究通过观察AG在体外实验中对胃癌细胞铁死亡的影响，进一步探讨AG作为抗癌药物与联合药物的潜能，为寻找新的抗肿瘤活性药提供理论参考。

1材料与方法

1.1 主要材料和试剂

胃癌细胞株AGS购自普诺赛生物有限公司。穿心莲内酯购自默克科技有限公司。DMEM培养基、胰蛋白酶、青-链霉素混合液、PBS缓冲液购自上海源培生物科技股份有限公司。胎牛血清购自赛默飞世尔科技有限公司。CCK-8试剂盒、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物有限公司。铁离子检测试剂盒购自北京普利莱科技有限公司。丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。C11 BODIPY581/591脂质过氧化探针购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。GPX4抗体、SLC7A11抗体购自上海艾博抗有限公司。TBST缓冲液、30%丙烯酰胺、过硫酸铵（ammonium persulphate，APS）等购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将胃癌细胞株AGS在DMEM培养基（含10%胎牛血清及1%青-链霉素混合液）37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞复苏、细胞传代均在生物安全柜中进行，细胞冻存于-80℃冰箱。胃癌AGS细胞分为阴性对照两组（NC两组）和穿心莲内酯药物处理两组（AG两组）。

1.2.2 CCK-8检测

细胞种板、加药处理后，弃掉含有药物的旧培养基，每孔加入100 μL新培养基，每孔再加入10 μL的CCK-8检测液，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育2 h。酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.3 铁离子检测

向样本中加入500 μL裂解液，摇床裂解2 h。每份样品中添加30 μL铁离子检测试剂，37 ℃孵育30 min。酶标仪选用550 nm波长测定吸光度。根据绘制的铁离子检测标准曲线及样品蛋白浓度计算细胞内Fe2+水平。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测

细胞种板、加药处理后，根据MDA试剂盒使用说明书，裂解液充分裂解细胞后，离心10 min后取上清液，加入TBA溶液混匀，95 ℃孵育60 min。取200 μL样品加入96孔板中，酶标仪选用532 nm波长测定吸光度。依据绘制的MDA标准曲线及样品蛋白浓度计算细胞内MDA水平。

1.2.5 GSH测定

细胞种板、加药处理后，细胞刮刮下细胞，加入5 mL的PBS缓冲液，离心10 min收集细胞，按照每106个细胞加入300 μL匀浆介质，进行超声破壁，离心后取上清置于冰上待测。根据产品说明书添加相关试剂，酶标仪在405 nm波长测定吸光度。依据绘制的GSH标准曲线计算细胞内GSH水平。

1.2.6 ROS检测

细胞种板、加药处理后，应用脂质过氧化荧光探针C11 BODIPY581/591、流式细胞仪评估细胞内ROS的水平。向待测细胞添加脂质过氧化荧光探针，在37 ℃、避光环境转给你孵育1 h。通过流式细胞仪检测细胞ROS水平。

1.2.7 蛋白质免疫印迹（western blot，WB）实验

使用RIPA裂解细胞20 min后，用细胞刮刮下细胞，转移至1.5 mL样品管中。4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min后取上清并提取蛋白。测定细胞蛋白浓度后，按照1：4体积添加蛋白上样缓冲液，充分混匀后在95 ℃金属浴中孵育5 min，在-20 ℃冰箱中保存备用。取15 μg蛋白样品进行电泳、转膜后，脱脂牛奶封闭2 h。将蛋白条带用TBST缓冲液清洗，一抗孵育过夜。二抗室温下孵育1 h。加入显影液，在暗室中使用显影仪显影。

1.2.8 统计学分析

数据采用GraphPad Prism 9软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，使用未配对t检验分析两组间的差异，使用单因素方差（ANOVA）分析多组间的差异，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 穿心莲内酯对胃癌细胞活力的影响

CCK-8实验结果显示：加入穿心莲内酯后，胃癌细胞的活力明显下降（P＜0.05）。

2.2 穿心莲内酯对胃癌细胞铁死亡的影响

铁死亡相关指标检测发现：加入穿心莲内酯后，细胞Fe2+浓度、MDA水平明显升高，GSH水平明显下降（P＜0.05）；流式细胞仪检测发现，AGS细胞发生铁死亡而累积的ROS水平明显升高（P＜0.05）。

2.3 穿心莲内酯对铁死亡相关蛋白表达水平的影响

通过提取细胞蛋白并进行WB实验发现：加入穿心莲内酯后，铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11表达水平明显下降，铁死亡激活。见图6。

3讨论

胃癌早期症状不明显，且缺乏特异性诊断标志物，临床上大多数患者发现时已处于进展期或晚期阶段。铁死亡是一种以脂质过氧化物、铁离子累积为主要特征的程序性死亡。研究显示，miR-375在体内外均可降低胃癌细胞的干性，直接靶向SLC7A11，并且触发SLC7A11依赖的铁死亡来减弱胃癌细胞的干性[5]。因此，铁死亡作为一个潜在的肿瘤治疗机制，在解决肿瘤耐药、抑制肿瘤生长方面有广泛的应用前景。

现代肿瘤治疗中，天然中草药单体因其产量大而稳定、副作用少等优点逐渐成为抗癌药及联合用药的最佳来源之一。以穿心莲内酯为代表的二萜类化合物，因其具有抗炎、调节免疫系统、抗肿瘤等药理作用，为穿心莲的药理活性提供了广泛的物质基础。研究表明，穿心莲内酯在胃癌[10]、肝癌等多种体内外肿瘤模型中具有不同的治疗功效。

本研究应用胃癌细胞AGS加入穿心莲内酯进行药物处理细胞后开展研究。通过细胞活力和铁死亡相关指标检测发现，穿心莲内酯对AGS细胞活力具有明显的抑制作用，能够明显诱导胃癌细胞铁死亡的发生。既往研究表明，铁死亡激活剂（如索拉非尼，埃拉斯汀等）通过直接或间接途径靶向核心分子GPX4，从而阻断其对复杂脂质氢过氧化反应的抑制作用，进而诱发铁死亡[6]。本研究通过WB实验证实，加入穿心莲内酯处理后，胃癌细胞铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11出现了明显降低，铁死亡激活。

综上所述，穿心莲内酯可通过影响GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平诱导胃癌细胞铁死亡的发生。但是对于穿心莲内酯影响胃癌细胞铁死亡具体靶向的作用机制有待进一步研究，以期为胃癌综合治疗提供更加充分的用药方案和治疗靶点参考。

参考文献

[1]闫丹措，陶嘉楠，马秀雯，等.TRIM蛋白家族在胃癌中作用的研究进展[J].山东医药，2024，64（1）：102-106.

[2]赖学倩，刘俊宏，王淼蕾，等.铁死亡与胃癌相关分子的关系及其临床应用研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志，2023，32（11）：1294-1298.

[3]荣耀，董凤源，唐明政，等.铁死亡在胃癌发生及治疗中的研究进展[J].肿瘤学杂志，2023，29（6）：470-478.

[4]王舟，汪文杰，徐伟，等.胃癌靶向治疗及其耐药机制的研究进展[J].山东医药，2024，64（1）：106-110.

[5]刘奇章，龚兴国.穿心莲内酯诱导胃癌细胞周期抑制和内源性凋亡[J].浙江大学学报（理学版），2017，44（4）：456-463.

[6]亓翠玲，王丽京，周鑫磊.穿心莲内酯抗肿瘤作用机制的研究进展[J].中国中药杂志，2007（20）：2095-2097.