盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性探究

摘要：目的 观察盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染的抑菌效果。方法 以雾化吸入耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（CRAB）的120只成年BALB/c雄鼠为研究对象，获得CRAB感染动物模型，将其随机分为实验组和对照组，每组各60例。对照组使用头孢哌酮舒巴坦钠灌胃治疗，实验组则在对照组治疗的基础上使用等量的盐酸小檗碱灌胃治疗，7 d为一周期，共治疗3个周期。比较用药后两组死亡率以及用药前后血清炎症标志物的变化。结果 对照组死亡率显著高于试验组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。治疗前，两组白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平对比差异不具有统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组IL-6、TNF-α明显下降，且组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的抑菌效果优于单独使用头孢哌酮舒巴坦。

关键词：碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌；盐酸小檗碱；头孢哌酮舒巴坦

鲍曼不动杆菌是一种条件致病菌，在环境中广泛分布，尤其在医院环境中分布更密集。该菌容易在患者多个部位定植，如消化道、呼吸道等部位，可引发医院获得性感染，耐药性极强[1]。由于抗生素的广泛使用，以及近年来检测水平大幅提高，鲍曼不动杆菌检出率也在不断增加。临床研究数据表明，鲍曼不动杆菌检出率仅次于大肠埃希菌，高达8.8%，其中反复的药物筛选使得这种细菌具有多重耐药性，如对亚胺培南、美罗培南和耐碳青霉烯等耐药，被认为是一种“超级细菌”，严重影响抗感染治疗效果，甚至导致患者死亡[2]。在众多抗生素中，其对头孢哌酮舒巴坦耐药性较低，为36.7%[3]。

对于耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌感染，目前使用的药物多为替加环素、多粘菌素，但这两种药物的副作用明显，在临床上的应用受到了极大的限制。《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》建议采用联合用药来治疗多重耐药不动杆菌，且剂量大，疗程长。已有多项国内外研究证实，部分中药成分具有抗菌能力[4]。小檗碱又名黄连素，是一种从黄连中提取的苄基异喹啉生物碱，被用于治疗肠道感染。本研究旨在观察盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染的抑菌效果。

1材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

盐酸小檗碱片，规格：25mg/片；注射用头孢哌酮舒巴坦钠，剂型：粉针剂，规格：1.5g（1.0g/0.5g）。白细胞介素6（IL-6）以及肿瘤坏死因子α（TNF-α） ELISA试剂盒。

1.2 动物模型制备

实验用动物为BALB/c雄性小鼠（6～8周龄；体重18～20 g），由南京模式动物研究所提供，将小鼠饲养3 d适应环境后经腹腔注射舒泰1 mg/只进行麻醉。麻醉后，将小鼠放入密闭塑料盒中（为使气道充分打开，将小鼠尽量垫高）。配置鲍曼不动杆菌菌液，浓度为108 CFU/ml，摇匀后置于超声雾化器中，连接好雾化管路（注意连接活性炭以收集残余气体），雾化速度为2 ml/min，雾化时间30 min。随后竖立小鼠，左右旋转体位。所有操作在生物安全柜中进行。于感染48 h后进行给药治疗，小鼠饲养在无特殊病原体（SPF级）动物房内，室温22～24℃、湿度保持在50%～70%，12 h明暗交替，自由摄食。

1.3 方法

对照组给予头孢哌酮舒巴坦1 mg/只，用0.9%氯化钠注射液1 ml稀释后灌胃治疗，间隔12 h给药1次。连续治疗3周。实验组联合使用头孢哌酮舒巴坦1 mg/只以及1 mg/只盐酸小檗碱，用0.9%氯化钠注射液1 ml稀释后静脉滴注治疗，间隔12 h给药1次。连续治疗3周。

1.4 外周血象检测

治疗前后对两组小鼠进行采血，眼眶静脉丛采血，将血液样本置于室温2 h，随后1 000×g离心20 min，吸取血清用于下一步细胞因子检测。

1.5 观察指标

治疗3周后，比较从治疗开始到结束两组的死亡率。治疗前后采用酶联免疫双抗体夹心法检测IL-6、TNF-α水平的变化。试剂盒购自南京基蛋生物科技有限公司，操作过程严格依据试剂盒内的说明书实施。主要步骤包括：全部标本通过1：100的比例稀释后依次向微孔板中加入，之后再将抗体于室温条件下进行40 min孵育（分别向其中滴加IL-6，浓度为10 pg/ml、50 pg/ml、100 pg/ml 、200 pg/ml标准品、阴性和阳性对照，TNF-α浓度为200 μg/L、100 μg/L、50 μg/L、25 μg/L标准品、阴性和阳性对照），随后进行5次洗板；在避光情况下滴加单抗（酶标记），室温条件下进行40 min的孵育，再5次洗板；加入底物给予15 min的反应后终止，于全自动酶标仪的分析仪（购自美国赛默飞世尔公司）上对其吸光值（A）进行检测。血清IL-6、TNF-α检测的批内和批间变异系数均小于5%，提示此次实验操作具有很好的精确度和重复性。

1.6 统计学分析

数据处理采用SPSS25.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用ｔ检验，计数资料用比率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 两组治疗后死亡率比较

实验组小鼠死亡率明显低于对照组，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组IL-6、TNF-α比较

治疗前，两组IL-6、TNF-α水平编辑差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组IL-6、TNF-α均明显下降，且实验组下降程度显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3讨论

近年来，随着广谱抗菌药物的大量使用及各种侵入性医疗技术的发展，鲍曼不动杆菌在医院细菌感染中所占的比例逐渐上升，已成为医院感染的主要条件致病菌，同时由于其对各类抗菌药物的耐药率的升高，给临床治疗带来较大困难[5～6]。此外，鲍曼不动杆菌属于非发酵菌属，为条件致病菌，是人体正常菌群的组成部分，广泛存在于自然环境、医院环境中，同时还具有强大的克隆传播、获得耐药性能力，故而广泛耐药、多重耐药以及全耐药的鲍曼不动杆菌呈世界性流行[7～8]。目前研究发现，鲍曼不动杆菌主要引起呼吸道感染，也可引起泌尿系感染、败血症等。旷南岳等[9]研究亦发现，鲍曼不动杆菌感染与院内感染死亡风险呈正相关。因此通过分析盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染的抑菌效果，对于治疗鲍曼不动杆菌感染意义重大[103]。

头孢哌酮舒巴坦具有抗菌作用强、抗菌谱广的特点，作为复合制剂[11]，其中的头孢哌酮可抑制细菌细胞壁，舒巴坦可抑制β-内酰胺酶，而且不可逆，两者复合后可使抵抗多种β-内酰胺酶降解的能力得到增强，协同抗菌活性[12]。应用头孢哌酮舒巴坦钠治疗碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌感染有一定的效果。但是由于鲍曼不动杆菌对其具有一定的耐药性，长期使用可能使其耐药性增强，导致治疗效果减弱。鲍曼不动杆菌感染会导致人体内的重要炎症因子（如IL-6、TNF-α）普遍升高，其原因可能是病原菌入侵机体产生的内毒素可激活炎性细胞（单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等），导致免疫功能异常，进而引起异常炎性反应，如白细胞释放大量的氧自由基，刺激氧化应激反应。因此，炎性因子变化情况与疾病的发生发展密切关联[13]。本研究结果显示，对照组死亡率显著高于试验组，P＜0.05。治疗前，两组白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平差异不具有统计学意义，P＞0.05；治疗后，两组IL-6、TNF-α明显下降，且组间差异具有统计学意义，P＜0.05。说明盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的抑菌效果显著。IL-6、TNF-α为常见的促炎因子，其水平高低可反映疾病严重情况。小檗碱又称黄连素，是一种异喹啉类生物碱，存在于小檗属、黄连属植物根茎中，具有调理肝脏、清热解毒等作用，不良反应小。

综上所述，盐酸小檗碱联合头孢哌酮舒巴坦对碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的抑菌效果优于单独使用头孢哌酮舒巴坦。本研究不足之处在于样本量较少且单一，得到的结果可能有一定的偏倚，今后进一步研究应增加样本量、样本种属以及临床实验。

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