血清标志物在甲胎蛋白阴性肝细胞癌早期诊断中的临床应用

摘要：肝细胞癌（HCC）是目前发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。甲胎蛋白（AFP）被普遍用于HCC的筛查，但由于30%的HCC中AFP并不升高，此时AFP不能筛查HCC，从而导致延误治疗。因此，用于早期诊断AFP阴性HCC的血清标志物显得尤为重要。故本文将对血清标志物在AFP阴性HCC早期诊断中的临床应用做一综述。

关键词：血清标志物;AFP;HCC;早期诊断

肝细胞癌（HCC）是目前发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，且是最常见的肝癌类型，约占原发性肝癌的90%，且亚洲地区占全球报告的75%～80%。HCC的总体发病率受肝炎病毒流行率和环境因素影响，而乙型肝炎病毒感染仍是HCC的主要危险因素。HCC患者的生存率不高，认为与大多数HCC在早期无法诊断有关。目前，欧美指南提出使用超声进行HCC早期检查，而亚洲建议超声和AFP结合早期诊断。但由于超声受到操作者水平的影响，在小肝硬化病灶中区分良恶性有限，加之30%的HCC中AFP阴性，造成超声以及AFP不能更好地早期发现HCC。因此，临床迫切需要找到能够早期诊断AFP阴性HCC的检查方法。故本文将概述以血清为重点的生物标志物的最新发现，并讨论它们作为HCC早期诊断和/或预后生物标志物的潜在临床应用，以及不同血清标志物的联合检测为临床带来的价值。

1异常凝血酶原（PIVKA-II）

由维生素K缺乏诱导的蛋白质或拮抗剂（PIVKA-II），也称为异常凝血酶原（DCP），并被认为是HCC特异的血清标志物。研究表明，血清PIVKA-II在HCC患者中明显高于良性肝病及健康人，诊断HCC的准确性优于AFP，可以作为HCC早期诊断标志物。并且，有利于区分AFP阴性HCC与健康人，敏感性78.33%，特异性高达91.3%;也有利于区分AFP阴性HCC与良性肝病，敏感性74.19%，特异性82.68%。血清PIVKA-II与HCC患者的肿瘤大小与分化程度呈正相关，且与肿瘤数量、淋巴转移和门静脉血栓（PVTT）形成也有关，其水平增高可以独立预测伴随PVTT风险增加，可见PIVKA-II是AFP阴性HCC早期诊断的良好指标。

血清PIVKA-II在早期诊断AFP阴性HCC的敏感性较低，这使其成为检测的争议。但联合AFP检测时，其AUC增至最高为0.946，敏感性和特异性明显高于单独检测，提高了早期诊断的准确性，对AFP起到补充作用，这也在多位学者的研究中得到证实。孔令希等[1]发现，PIVKA-II、AFP、红细胞体积分布宽度（RDW）三者联合检测可提高HCC的早期诊断，并提高检测敏感性至97.56%，而串联检测特异性提高至99.21%，远高于单独检测。薄维波等[2]提出在AFP阴性HCC患者中，PIVKA-II、细胞质胸苷激酶1（TK1）联合检测敏感性提高至92.31%，远高于二者单独检测（80.77%，57.69%），三者联合检测可提高HCC的早期诊断，减少AFP阴性的HCC病例漏检。

2甲胎蛋白异质体（AFP-L3）

由于AFP的糖链具有不均一性，与小扁豆凝集素（LCA）结合力不同，称其为AFP异质体（AFP-L），通过蛋白质印迹可鉴定出AFP糖型的三个分离带，分别是AFP-L1（非结合）、AFP-L2（中间结合）和AFP-L3（LCA反应性）。AFP-L1通常与慢性肝炎的肝脏炎症相关，而AFP-L3对HCC更具特异性，AFP-L2来源于卵黄囊，可在妊娠期间的母体血清中检测到。AFP-L3%则为AFP-L3占总AFP的比值。AFP-L3在肿瘤的初始阶段分泌，可以作为HCC的早期诊断标志物。ZhouJM等发现，AFP-L3%在诊断早期HCC时具有高特异性（92%），低敏感性（34%），但微量总分析系统可提高其敏感性。也有其他学者研究表明，AFP-L3在HCC早期病例中显示出极高的敏感性、特异性、阳性及阴性预测值（全高达100%）。这也在日本等国家得到认可，将AFP-L3%作为早期诊断HCC的可靠指标。AFP-L3的截止值为23ng/ml时，其预测HCC的敏感性为97.5%，特异性高达100%，而HCC治疗后，AFP-L3的持续升高更是与生存期较短相关。由此可见，AFP-L3是临床应用可靠的指标，值得推广。

多项指标联合检测往往可提高检测的准确性，优于单个指标的临床价值。有研究者发现，AFP-L3%和DCP两者联合检测诊断AFP低水平HCC的曲线下面积（AUC）增高至0.953，敏感性增高至89.36%，优于AFP-L3%、DCP单独诊断，加上AFP三者联合检测的诊断优势比（DOR）值为28.33，表明AFP、AFP-L3%、DCP三者联合检测更能提高准确性，且联合检测的敏感性、特异性高于单独检测，组合间的AUC增加至0.95以上。也有其他观点认为，若两两联合检测时，DCP、AFP联合的AUC最大（0.931），而三者联合检测反而降低，提出DCP与AFP联合为最佳组合方式。但数据尚少，还需进一步研究证实。

3磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）

GPC3属于蛋白聚糖家族，在健康成人或非恶性肝脏疾病患者中无法检测到，但在胎儿及大多数HCC患者中过度表达，可作为HCC早期诊断的特异性标志物。研究发现，在68名AFP阴性患者中，43名患者GPC3水平升高，且与AFP无相关性，说明GPC3可作为AFP阴性HCC的早期诊断指标;在65名肿瘤直径≤3cm患者中，AFP阳性32例（49.2%），GPC3阳性44例（67.7%），可见在病灶较小患者中，GPC3比AFP更敏感 ，在早期HCC诊断中GPC3更优于AFP。

尽管在诊断HCC方面，GPC3优于AFP，但它仍然缺乏100%的敏感性和特异性。在经三相CT诊断的患者中，有些患者的GPC3仍为阴性或正常水平（低于临界点1.5ng/ml），而联合检测AFP、GPC3可显著提高诊断的准确性。有研究者发现，AFP、DCP、GPC3三者联合检测，可互为补充，减少AFP阴性HCC的漏检率，提高HCC诊断的敏感性、特异性、准确性。也有人提出将七种血清标志物（AFP-L3、GPC3、DCP、糖类抗原199（CA199）、高尔基体跨膜糖蛋白73（GP73）、铁蛋白，癌胚抗原）联合检测，对AFP阴性HCC最具有诊断价值。可见联合多种标志物检测能提高AFP阴性HCC的早期诊断率。

4分泌型糖蛋白（DKK1）

DKK-1是一种分泌蛋白，可直接分泌到血液中，抑制经典的Wnt信号通路，它在除胎盘和胚胎组织外的正常成人组织中不表达。在成人中，该蛋白在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等高表达，也与肝癌的转移和预后有关。DKK-1在HCC患者中高于肝硬化患者及对照组，临界值>4.04ng/ml时，敏感性和特异性高达100%和97.5%。在AFP阴性HCC中，DKK-1表现出较好的诊断准确性（特异性90.0%，敏感性70.4%），联合AFP更能提高敏感性到88%，并且DKK-1与肿瘤大小及淋巴转移成正相关，可用于预后及复发判断。

现有研究发现，DKK1与其他标志物联合检测将大大提高诊断准确性，在肝癌发生的不同阶段，研究GP73、Midkine（MDK）和DKK-1蛋白的联合使用，发现在不同的标记组合中，Gp73和DKK-1组合显示出最高的特异性和敏感性（93.1%、97.4%），这有利于AFP阴性HCC的早期诊断。

5微循环RNA（miRNA）

miRNA是一种大约有22个核苷酸的小型非编码RNA，通过作为肿瘤促进剂或抑制剂来控制HCC中的细胞增殖、迁移、侵袭和发展，这些使miRNA成了早期诊断HCC的理想标志物。目前，已有200多种miRNAS在肝癌中有异常表达，有观点认为这10种标志物（miR-1、miR-16、let-7f、miR-21、miR-24-3p、miR-122、miR-139、miR-215、miR-221、miR-222）有望成为早期诊断HCC的可靠标志物。其中，miR-21、miR-122被认为是独立预测HCC最有希望的标志物，miR-21、miR-122和miR-192在AFP阴性HCC中也具有较高的准确性。miR-125b可以区分AFP阴性HCC患者与HBV感染，其AUC高达0.943，这些表明miRNA中的各项标志物可用于AFP阴性HCC的早期诊断。miR-296的低表达与大肿瘤及晚期临床分期相关，低miR-137表达与淋巴转移或血管侵犯有关，可见miRNA随疾病的进展而发生变化，有助于临床医生对病情的掌握。

也有其他研究者发现，miRNA的组合有利于HCC的早期诊断，比如上调的3种miRNA（miR-25、miR-375和let-7f）的组合有助于区分HBV/HCV相关的HCC患者和良性肝病患者，尤其是单独的miR-375诊断HCC的敏感性为100%，特异性为96%;而且由miR-29a、miR-29c、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505组成的miRNA分类器可用于小、早期和AFP阴性HCC患者的诊断。以上表明，miRNA组的测量可以用于检测AFP阴性的HCC患者，并提高诊断准确性。但目前对于最佳miRNA组合的模式缺乏统一的认识，仍需要大量的研究。也发现29种不同的miRNA和AFP组合中，miR-331-3p和AFP，miR-182、331-3p和AFP，miR-21、4429和AFP的组合显示出较高的敏感性（>90%）和特异性（>90%）。而miRNA-21联合DCP、AFP后，准确度提高到90.24%，高于单独检测及两两联检，能够弥补AFP诊断不足的情况，这些说明miRNA与其他标志物的联合检测有利于提高AFP阴性HCC疾病的早期诊断。

6热休克蛋白90α（Hsp90α）

Hsp90α是热休克蛋白家族的成员，可调节许多不同的细胞过程，包括细胞增殖，运动，血管生成，信号转导和适应压力。Hsp90α使突变的癌蛋白能够避免错误折叠和降解，并允许恶性转化，被认为是HCC治疗早期检测、预后和监督的可靠标志物。LIU等人发现，Hsp90α能将所有癌症患者与所有对照区分开来，最佳诊断临界值为69.19ng/mL，并且在检测早期癌症患者中发现了相似的结果，还可以维持癌症亚型的广谱性，特别是对于AFP阴性HCC患者，其敏感性高达91.78%，特异性高达91.96%。由此可见，Hsp90α可用于AFP阴性HCC患者的早期诊断。

在对409例HCC、101例肝良性疾病和78例健康人研究发现，HCC患者中的Hsp90α水平高于对照组，Hsp90α的表达与肿瘤的分期、分化、淋巴结转移和血栓形成呈正相关，Hsp90α、AFP和TK1三者组合可提高诊断灵敏度（89.24%）和AUC（0.919）。可见联合检测能够提高HCC的早期诊断率，避免AFP阴性HCC患者的漏检。

参考文献

[1] 孔令希，覃山子，秦雪，等.PIVKA-Ⅱ、AFP、RDW联合检测在肝细胞癌中的诊断价值[J].广西医科大学学报，2018，35（6）：839-841.

[2] 薄维波，李海英，安仲武，等.血清PIVKA-Ⅱ、TK1和AFP联合检测在肝细胞癌诊断中的价值[J].国际检验医学杂志，2021，42（11）：1317-1321.