观察分子生物学技术应用于病原微生物检验的效果

【摘要】目的：探讨分子生物学技术在病原微生物检验中的应用效果。方法：选取2022年3月—2023年2月本院80例病原微生物检验患者，所有患者分别采取常规RT-PCR检验（对照组）与实时荧光RT-PCR检验（观察组），对比两组检验结果。结果：经病理检查，58例阳性，22例阴性；对照组阳性检出率是50.00%，观察组是70.00%，观察组较对照组高（P<0.05）。观察组检验准确度较对照组高（P<0.05）；两组特异度未见明显差异（P>0.05）。观察组肺炎克雷伯菌、轮状病毒、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌检出率比对照组高（P<0.05）。结论：实时荧光RT-PCR检验技术在病原微生物检验中应用效果较常规RT-PCR优，不仅可以提高阳性检出率，而且可以提高诊断准确度和灵敏度。

【关键词】病原微生物；分子生物学技术；常规RT-PCR

Observation of the effectiveness of molecular biology techniques in the detection of pathogenic microorganisms

LU Qixin

Lijiang People’s Hospital， Lijiang， Yunnan 674100， China

【Abstract】Objective：To explore the application effect of molecular biology techniques in the detection of pathogenic microorganisms. Methods：From March 2022 to February 2023，80 patients who underwent pathogen microbiological testing in our hospital were selected.All patients underwent routine RT-PCR testing （the control group） and real-time fluorescence RT-PCR testing （the observation group），and the test results of the two groups were compared.Results：After pathological examination，58 cases were positive and 22 cases were negative；The positive detection rate of the control group was 50.00%，while that of the observation group was 70.00%.The observation group was higher than the control group （P<0.05）.The accuracy of the observation group was higher than that of the control group （P<0.05）；There was no significant difference in specificity between the two groups （P>0.05）.The detection rates of Klebsiella pneumoniae，Rotavirus，Escherichia coli and Staphylococcus aureus in the observation group were higher than those in the control group （P<0.05）.Conclusion：The application of real-time fluorescence RT-PCR technology in the detection of pathogenic microorganisms is more effective than conventional RT-PCR. It can not only improve the positive detection rate，but also enhance the diagnostic accuracy and sensitivity.

【Key？Words】Pathogenic microorganisms； Molecular biology techniques； Conventional RT-PCR

随着分子生物学技术日益发展，病原微生物的应用范围不断扩大。传统微生物检验方法存在操作复杂、繁琐、检测时间长、诊断准确度低等不足，而分子生物学技术的出现，不仅可以弥补传统微生物检测的不足，且为其检验提供了新的方法[1]。分子生物学技术有很多，包括核酸测序、实时荧光RT-PCR、PCR芯片技术等，除有助于检测特异度及灵敏度的提高外，可以达到定量检测微生物，并鉴定微生物类型[2]。临床诊断过程中，分子生物学技术被广泛应用于病原微生物检测及诊断，为临床治疗提供了重要参考[3]。但是，当前针对分子生物学技术在病原微生物检验中的应用效果仍需要深入探讨，基于此，本文针对分子生物学技术在病原微生物检验中的应用效果进行分析，详情如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年3月—2023年2月本院80例病原微生物检验患者，其中50例男，30例女；年龄：21～65岁，均龄（43.56±2.19）岁；体重：48～79kg，平均体重（65.23±3.17）kg；文化水平：小学15例，初中23例，高中21例，大专及大专以上21例。经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 对照组

常规RT-PCR检验：首先，自待检样本中提取RNA，采用RNA提取试剂盒提取，保证RNA的完整性及纯度。其次，通过逆转录酶将RNA逆转录成相应的cDNA。再次，在PCR扩增反应中，将cDNA作为末班，与缓冲液、特异性引物、DNA聚合酶及核酸酶混合在一起，在一系列温度循环中实施扩增反应，扩增产物经电泳分析，根据目标片段大小明确微生物RNA的存在与数量。最后，通过其他方法或者测序验证PCR产物的特异性。

1.2.2 观察组

实时荧光RT-PCR检验：首先，在待检样本中提取RNA，保证提取RNA的纯度及质量。其次，采用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。再次，准备实时荧光RT-PCR反应体系，包括核酸酶、模板cDNA、缓冲液、特异性引物及荧光探针等。然后，将混合液添加在实时PCR仪中，实施PCR扩增反应，同时监测荧光信号的强度。实时PCR仪能够实时记录PCR反应过程中的荧光信号变化，根据荧光信号的增长信号，定量分析待检微生物RNA的数量。最后，通过标准曲线或者相对定量法对微生物RNA的表达水平进行计算。

1.3 观察指标

1.3.1 观察两组阳性检出情况。

1.3.2 观察两组诊断准确度、灵敏度、特异度。

1.3.3 观察两组检验指标，包括肺炎克雷伯菌、轮状病毒、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用（%）表示，进行x2检验，计量资料采用（x±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阳性检出率对比

观察组阳性检出率较对照组更高（P<0.05），见表1。

2.2 两组诊断效能比较

金标准（病理检查）：58例阳性，阳性率72.50%；22例阴性，阴性率27.50%；对照组：40例阳性，40例阴性；观察组：56例阳性，24例阴性。观察组检验准确度及灵敏度较对照组高（P<0.05）；两组特异度未见明显差异（P>0.05），见表2、3与4。

2.3 两组检验结果比较

观察组肺炎克雷伯菌、轮状病毒、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌检出率比对照组高（P<0.05），见表5。

3 讨论

病原微生物检验是现阶段临床常用检验方式之一，在临床疾病、食品、饮用水及医疗用品检验中应用范围广。近年来，人们对自身疾病认知度越来越高，再加之对微生物认知不断增多，临床上越来越重视病原微生物检验。据有关资料显示，日常生活中，不仅有机体自身特异性原发病变外，还有常见疾病类型，其通常是由病毒、细菌等病原微生物感染造成的，因病原微生物类型不同，临床表现也不同，有些患者可能是因为病原微生物感染造成的，需及早确诊，并采取抗感染治疗，控制病情发展[4]。病原微生物以往检验时，主要通过病原菌分离培养法、染色镜检法、血清学试验等方法进行，尽管以上方法具有一定效果，但是耗时长，操作流程复杂，极易受到外界环境影响，导致检查结果降低[5]。随着基因诊断技术飞速发展，分子生物学技术逐渐被应用于病原微生物检验中，并取得了显著效果，分子生物学技术的应用，有助于检验可靠性及准确性提高，可推动病原微生物检验的发展[6]。

目前，在疾病检测中，已有大量的微生物检测方法，并已获得较好的结果。目前，微生物学检测方法在病原微生物检测方面具有明显的优越性，对疾病检测的有效性也有很大的帮助。有关研究显示[7]，分子检测技术在医学、遗传学、生物学等领域具有显著的作用，对多种疾病的防治具有重要的指导意义。本项目拟采用PCR方法对病原微生物进行检测，利用PCR方法对特异性DNA序列进行放大，实现特异性DNA在细胞内高效的复制，提高痕量DNA含量。PCR方法的复制与自然DNA相近，在检测中需要将模板DNA加热至93℃，使其在93℃内保持一定的温度，当PCR扩增产生双链DNA，并使其保持游离状态，最后在引物的帮助下生成单股DNA，从而实现后续的化学合成。在此基础上，以DNA聚合酶为基础，通过核酸聚合酶结合核酸的原理，构建出一条完整的DNA半保持复制链。通过反复的运算，可以得到用于对DNA进行放大和扩增的多条半保持的复制链。该方法具有很高的敏感性和特异性，PCR的时间通常为2～4h，并且无需进行细胞培养和病毒的分离等操作，可以选择DNA或RNA的粗品作为放大模板，然后对细胞、血液、头发、活组织等进行DNA扩增检测。PCR检测在病原微生物检测中具有重要的意义：（1）呼吸系统疾病的致病微生物检测：呼吸系统疾病是临床上常见且高发的疾病，主要是寄生虫、病毒、放线菌、衣原体、细菌等病原微生物。传统的细菌培养方法通常要几个星期的时间才能出报告，这会耽误患者病情。在此过程中，利用荧光PCR的方法，加速引物和DNA聚合酶的结合，在2.5h内，就可以发现新的致病细菌，并进行针对性的治疗，从而达到控制疾病的目的。（2）感染性疾病的快速检查：该方法可高效地测定目标DNA、原虫、多种细菌和真菌，具有很高的敏感性和特异性，在临床检查中具有很高的自动化水平，可以提高核酸的阳性率，为感染性疾病的诊治奠定基础。通过将PCR与分子生物学相融合，可以解决目前临床上不能区分的问题，提高临床疗效，防止出现肠道疾病。经过此次研究发现，观察组阳性检出率较对照组高（P<0.05）。由此可见，与常规RT-PCR检验对比，实时荧光RT-PCR阳性检出率更高。

综上所述，实时荧光RT-PCR检验技术在病原微生物检验中应用效果较常规RT-PCR优，除了可以提高阳性检出率，还可以提高诊断准确度和灵敏度。

参考文献

[1] 董娅.实时荧光定量PCR法对ICU患者痰液标本中鲍曼不动杆菌耐药基因的检测及其评价[J].临床研究，2024，32（1）：150-152.

[2] 徐伟玲，于少飞.病原靶向二代测序在下呼吸道感染病原体诊断中应用价值研究进展[J].检验医学与临床，2023，20（20）： 3068-3072.

[3] 杨文杰，王晓明，童文娟，等.PCR-荧光探针法和核酸序列测定法对呼吸道病原体的检测效能比较及呼吸道病原体的流行特征分析[J].浙江医学，2023，45（16）：1704-1708.

[4] 孙爱青，王丽花，杨秀梅，等.基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测兰花环斑病毒方法的建立[J].微生物学通报，2023，50（10）：4510-4521.

[5] 郑文改，杨雨鑫，王鹏涵，等.RT-PCR法对感染性疾病患者检测效能分析[J].临床心身疾病杂志，2023， 29（3）：113-116.

[6] 徐银娟，赵国连，崔晓利，等.实时荧光RNA恒温检测在气管支气管结核疗效监测中的应用价值[J].中国防痨杂志，2023，45（1）：79-84.

[7] 马亚楠，谭兵，徐磊，等.实时荧光定量PCR法对ICU患者痰液标本中鲍曼不动杆菌耐药基因的检测及其评价[J].吉林大学学报（医学版），2022，48（6）： 1623-1628.