UPLC-MS/MS法测定花椒中黄曲霉毒素的含量

摘 要：本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）测定花椒中4种黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的方法。试样采用84%乙腈-水溶液提取，液-液分配净化，采用UPLC-MS/MS仪器进行检测，外标法定量。结果表明，4种黄曲霉毒素在各自线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，AFB1和AFG1的检出限为0.25 µg·kg-1，AFB2和AFG2的检出限为0.15 µg·kg-1，定量限均为0.50 µg·kg-1。4种黄曲霉毒素的加标回收率在79.8%～100.8%，相对标准偏差在1.39%～6.49%。该方法操作简单、灵敏度高、成本低，能够满足花椒样品中黄曲霉毒素含量的测定要求。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）；花椒；黄曲霉毒素

Determination of Aflatoxins Content in Zanthoxylum bungeanum by UPLC-MS/MS Method

GUO Zhongli， LIU Lihua， ZHAO Cui， HAN Xiaona

（Qingdao Chengyu Food Testing Co.， Ltd.， Qingdao 266108， China）

Abstract： An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for the determination of four aflatoxins （AFB1， AFB2， AFG1 and AFG2） in Zanthoxylum bungeanum. The samples were extracted by 84% acetonitrile-aqueous solution， purified by liquid-liquid distribution， detected by UPLC-MS/MS instrument， and quantified by external standard method. The results showed that the four aflatoxins had good linear relationships in their respective linear ranges， and the correlation coefficients were all greater than 0.999. The detection limits of AFB1 and AFG1 were 0.25 µg·kg-1， and the detection limits of AFB2 and AFG2 were 0.15 µg·kg-1. The limits of quantification were 0.50 µg·kg-1. The recoveries of four aflatoxins ranged from 79.8% to 100.8%， and the relative standard deviations ranged from 1.39% to 6.49%. The method has the advantages of simple operation， high sensitivity and low cost， and can meet the requirements of determination of aflatoxins in Zanthoxylum bungeanum sample.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; Zanthoxylum bungeanum; aflatoxins

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，是目前已知最强的天然致癌物质之一，其对肝脏伤害最为严重，可导致肝脏功能下降，增加罹患肝癌的风险。黄曲霉毒素主要存在于霉变的谷物、坚果、干果、豆类、食用油和香料类等食品中。

目前，各国对花椒中黄曲霉毒素的限量标准不统一。我国食品安全国家标准中仅对黄曲霉毒素B1提出了限量要求[1]，且限量的食品中没有花椒；欧盟也未对花椒中的4种黄曲霉毒素提出限量要求，但是对部分香料进行了规定，其中黄曲霉毒素B1最大残留量为5 µg·kg-1，黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的最大残留总量为10 µg·kg-1。

黄曲霉毒素的检测方法有多种，包括液相色谱串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法和薄层色谱法等[2]。近年来，液相色谱串联质谱法因其灵敏度高、准确性强、速度快以及可靠性强等优点，在检测如花椒这类复杂基质中的黄曲霉毒素残留量时，该方法得到了广泛应用[3-5]。由于花椒基质复杂，在处理样品时需要使用内标法及固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）柱，导致实验成本过高。基于此，本文在现有检测方法的基础上进行优化，建立一种UPLC-MS/MS法测定花椒中黄曲霉毒素含量的方法，以达到降本增效的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯）；正己烷、氯化钠（分析纯）；甲酸铵（色谱纯，纯度为99%）；实验用水（一级）。

黄曲霉毒素混标储备液：AFB1（浓度为1.0 μg·mL-1）、AFB2（浓度为0.3 μg·mL-1）、AFG1（浓度为1.0 μg·mL-1）和AFG2（浓度为0.3 μg·mL-1）。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪、Xevo TQ-XS串联质谱联用仪，美国Waters公司；Xbridge BEH C18 XP Column色谱柱（2.1 mm×75 mm，2.5 µm），美国Waters公司；粉碎机，德国‌福维克家电有限公司；PL602-L型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；BB2000S型超声波清洗仪，美国必能信超声有限公司；V·DX型振荡仪，日本IWAKI SANGYO公司；H-103N型离心机（转速≥3 500 r·min-1），日本KOKUSAN株式会社；TTM-1型涡旋混合器，日本SIBATA柴田科学株式会社。

1.3 黄曲霉毒素混标标准工作液的配制

准确吸取1 mL黄曲霉毒素标准混标储备液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的浓度分别为100、30、100 μg·L-1和30 μg·L-1的标准工作液。准确移取黄曲霉毒素标准工作液2、4、10、20、40 μL和100 μL，用80%甲醇-水溶液稀释至1 mL，配制成AFB1、AFG1浓度分别为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1，AFB2、AFG2浓度分别为0.06、0.12、0.30、0.60、1.20 μg·L-1和3.00 μg·L-1的标准系列溶液，供UPLC-MS/MS测定。

1.4 样品处理

（1）提取。选取花椒样品，用粉碎机粉碎至均匀粉末状。称取2 g花椒粉（精确至0.01 g）于50 mL具塞离心管中，加入20 mL 84%乙腈-水溶液超声30 min，4 200 r·min-1离心3 min，用吸管吸取全部提取液至50 mL具塞离心管中，再加入20 mL 84%乙腈-水溶液重复提取1次，合并2次提取液，用乙腈定容至50 mL。

（2）净化。准确移取5 mL提取液于50 mL离心管中，加入4 g氯化钠，5 mL水，10 mL正己烷，10 mL乙腈振荡20 min，离心（4 200 r·min-1，3 min），取中间层（乙腈）于50 mL旋干瓶中。

（3）浓缩。40 ℃减压浓缩至近干，氮气吹干。加入80%甲醇-水溶液1 mL定容，涡旋1 min，过0.22 μm微孔滤膜，采用UPLC-MS/MS法测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 液相色谱条件

Xbridge BEH C18 XP Column色谱柱（2.1 mm×75 mm，2.5 µm）；流动相A为含有0.01%甲酸的2 mmol·L-1甲酸铵水溶液，B相为含有0.01%甲酸的2 mmol·L-1甲酸铵甲醇溶液；流速：0.4 mL·min-1；柱温；40 ℃；进样量：1 µL。梯度洗脱条件：0～0.5 min，97%A；0.5～4.0 min，97%→60%A；4.0～5.5 min，60%→50%A；5.5～6.5 min，50%→2%A；6.5～9.0 min，2%A；9.0～9.1 min，2%→97%A；9.1～10.0 min，97%A。

1.5.2 质谱条件

电离电压：0.5 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气流速：16.7 L·min-1；锥孔反吹气流速：2.5 L·min-1；采集模式：正离子模式（ESI+），多反应监测模式。AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的质谱条件见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以黄曲霉毒素各自的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性方程、检出限和定量限结果见表2。由表2可知，4种黄曲霉毒素在各自线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，AFB1和AFG1的检出限为0.25 µg·kg-1，AFB2和AFG2的检出限为0.15 µg·kg-1，定量限均为0.50 µg·kg-1。

2.2 方法灵敏度

在花椒空白试样中添加黄曲霉毒素混标标准工作液溶液，当AFB1、AFG1添加浓度为0.25 µg·kg-1，AFB2、AFG2添加浓度为0.15 µg·kg-1时，信噪比

（S/N）＞3，故将其作为方法的检出限；AFB1、AFB2、AFG1和AFG2添加浓度为0.50 µg·kg-1时，信噪比（S/N）＞10，将其作为方法的定量限。

2.3 准确度与精密度

在2 g花椒空白样品中分别加入3个浓度水平的黄曲霉毒素混标标准工作液，进行加标回收试验。结果表明，目标物质的回收率在79.8%～100.8%，相对标准偏差在1.39%～6.49%，准确度和精密度均能满足有关法规要求。重复6次添加回收实验的平均回收率和相对标准偏差数据见表3。

3 结论

本文在GB 5009.22—2016基础上，建立了一种UPLC-MS/MS法测定花椒中黄曲霉毒素含量的方法。通过改变净化方法，将SPE柱净化改为液-液分配净化，并降低了样品的稀释倍率。此外，通过降低进样量、改变流动相梯度，最终达到降低基质效应的目的。方法中AFB1、AFG1的检出限为0.25 µg·kg-1，AFB2、AFG2的检出限为0.15 µg·kg-1，定量限均为0.5 µg·kg-1。本方法操作简单、灵敏度高、成本低，适用于检测花椒样品中黄曲霉毒素的含量。

参考文献

[1]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.

[2]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定：GB 5009.22—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[3]汤富彬，钟冬莲，沈丹玉，等.高效液相色谱-串联质谱法测定坚果中的黄曲霉毒素[C]//第十届中国林业青年学术论坛论文集.南京：中国林学会，2012：1-5.

[4]伍旭东，罗发美，车涛，等.高效液相色谱串联质谱法测定普洱茶茶籽油中的黄曲霉毒素B1[J].光谱实验室，2014，31（5）：610-616.

[5]赵庆林，王孟阳，姚晨，等.超高效液相色谱串联质谱法检测山药丸中4种黄曲霉毒素[J].中国药业，2024，33（23）：67-70.