超高效液相色谱－串联质谱法测定火麻啤酒中大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚

Determination of Cannabinol， Cannabidiol and Δ9 1 Tetrahydrocannabinol in Hemp Beer by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Faze12， CHEN Yuemeng， XIAO Dexin4， ZHAO Yuwang'， CHEN Shunqin1²， ZHANG Qiaojun1.2*

（1.Department or Forensic Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 55oo04， China; 2.School ofForensic

Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 55oo04， China; 3.Guiyang City Public Security Bureau Drug

Testing Center， Guiyang 550o08， China; 4.Guizhou Wanfu Xianyi Testing Technology Co.，Ltd.，Guiyang 550009， China; 5.School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 56l1o0， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of cannabinol （CBN），cannabidiol （CBD）， and Δ9 -tetrahydrocannabinol （THC） in hemp beer using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Method： The samples were extracted with ethyl acetate and subjected to gradient elution with water （containing 0.25% formic acid and 0.2% ammonium formate） and acetonitrile. Separation was performed on a Waters ACQUITY HSS T3 column. Detection was carried out using electrospray ionization in multiple reaction monitoring mode， with quantification by external standard method.Result： CBN，CBD，and THC showed good linear relationship in the range of ，and the correlation coefficient r value was greater than O.999. At the three addition levels of 1， 10ng⋅mL^-1 and 100ng⋅mL^-1 ，the sample recoveries were （20 72.9%～106.4% ， the matrix effect was -2.5%～11.3% ， the accuracy was -21.1%～-9.8% ， In the relative standard deviation （RSD）， the intra-day RSD was 2.3%～11.2% ，theinter-day RSDwas 3.5%～14.2% ，the detection limit was 0.5ng⋅mL^-1 ，and the quantification limit was 10ng⋅mL^-1 . Conclusion： This method is simple， rapid， sensitive， andrequires lessreagents in the pretreatment processItcan provide reliable technical support for the identification of illegal cannabis components in food safety supervision and public security drug enforcement.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; cannabidiol; cannabinol; Δ 9-tetrahydrocannabinol; illegal addition

火麻，属桑科大麻属，为一年生直立草本植物，其起源可追溯至锡金、不丹、印度及中亚等地区。在我国，火麻具有悠久的使用历史，被列为“麻、麦、稷、黍、豆”五谷之一[1-2]。火麻茎皮纤维质地坚韧，是制作麻布、纺线、绳索、渔网及纸的优质原料。此外，火麻还具有多种药理功能，包括养护肝肾、延缓衰老、缓解头痛、助眠、抗癌、抗炎和免疫调节等[3]。因具有含油丰富、可食用、药理活性突出等特点，火麻被广泛开发为各类衍生产品，如大麻二酚（Cannabidiol，CBD）保健品、火麻油、火麻啤酒、巧克力、麻仁软胶囊、医用纱布和麻仁饲料等[4-5]

火麻中大麻素成分包括四氢大麻酚（△9-Tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚、大麻酚（Cannabinol，CBN），是其主要的药理活性物质[。研究显示，大麻二酚对人类子宫内膜癌Ishikawa细胞具有细胞毒性，可以显著抑制细胞的增殖和迁移能力[7-8]；另有研究指出，大麻素对存在阈下失眠症状人群的睡眠质量、失眠症状及健康相关生活质量具有显著改善作用[。然而，四氢大麻酚等成分也存在一定的毒性作用，如孕期接触四氢大麻酚可能影响后代的心血管发育[10]。普通人群口服摄人大麻二酚分离物的可接受每日摄入量上限仅为0.43mg^.kg^-1 bw[11]。临床前模型研究表明，产前大麻素暴露会对后代的学习记忆、行为技能、睡眠及注意力产生负面影响[12]。尤其需要关注的是，四氢大麻酚是火麻中对中枢神经系统作用最强的精神活性成分，具有成瘾性和依赖性，长期使用会成瘾和产生依赖[13]。因此，食品中不得超过工业大麻限量标准添加四氢大麻酚。目前，国际上主要根据四氢大麻酚和大麻二酚的含量及比值区别毒品大麻和工业大麻（ THC<0.3% CBD>0.3% THC/CBD<1 ）[14]

近年来，随着火麻研究的不断深入，其衍生产品逐渐进入人们的日常生活。其中，火麻啤酒颠覆传统啤酒酿造原料，创新性地加人了工业大麻火麻，广受欢迎。然而，目前市面上的火麻啤酒品质参差不齐，包括国产火麻啤酒和通过跨境电商等渠道流入国内的产品，其四氢大麻酚等精神活性成分的含量缺乏有效监管[15]。更有不法分子非法添加高剂量四氢大麻酚至火麻啤酒中，使消费者产生成瘾和依赖，进而获取暴利，严重威胁消费者健康，甚至可能引发食品安全事件。因此，建立火麻啤酒中四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚成分的检测方法，对于火麻啤酒的安全检测和质量监管具有重要意义。

目前，四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚的常见分析方法包括高效液相色谱法[16-17]、胶体金免疫层析法[18]、气相色谱－质谱联用法[19]、液相色谱－串联质谱法[20-29]。其中，高效液相色谱法灵敏度低，受样品干扰较大，不适合痕量分析；气相色谱－质谱联用法需要对样品进行衍生化处理，该过程中耐酸、耐热性差的大麻素类化合物如大麻二酚可能分解，造成检测结果不准确，且操作烦琐、耗时；液相色谱－质谱联用法不需要衍生化处理，对样品不会造成破坏，耗时短、灵敏度高、准确性高，已成为大麻素类化合物定性定量分析的主流方法。然而，目前尚缺乏针对火麻啤酒中四氢大麻酚、大麻二酚和大麻酚系统分析方法的报道。基于此，本研究基于超高效液相色谱－串联质谱技术建立了火麻啤酒中四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚的分析检测方法，该方法具有较强的实用价值，可为食品安全监管以及公安禁毒领域鉴定非法大麻成分提供重要的方法参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

大麻酚标准品、大麻二酚标准品、四氢大麻酚标准品（ 1.0mgmL^-1 ），上海市刑事科学技术研究院;甲醇、乙醇、乙晴（色谱纯），德国默克公司；异丙醇（色谱纯）、甲酸（质谱纯），赛默飞世尔科技公司；乙酸乙酯（含量 ⩾99.5% ），国药集团化学试剂有限公司；甲酸铵（色谱纯），美国希格玛公司；超纯水。

1.2仪器设备

ACQUITYUPLC/SCIEX5500三重四极杆液质联用仪，美国Waters公司；ACQUITYHSST3色谱柱，美国Waters公司；氮吹仪，英国Biotage公司；超声波清洗器，德国埃尔玛公司；离心机，德国赛默飞世尔科技公司；涡旋混合器，广东省科寅实验室设备有限公司；Milli-Q纯水仪，德国默克公司。

1.3仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：WatersACQUITYHSST3（ 100mm× 2.1mm ， 1.8μm ）；柱温： 40°C ；进样量： 1μL ：流速： 0.35mL⋅min^-1 ；流动相：A为（含 0.25% 甲酸、0.2% 甲酸铵， u/ν ）水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～4min ： 60%95%B . 4～6min ： 95%B . 6～ 6.5min ： 95%60%B ； 6.5～10min ： 60% 。

1.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子模式；扫描方式：多反应监测模式；气帘气： 40psi ；碰撞气：9psi；喷雾电压： 5500V ；离子源温度： 500°C ；喷雾气：35psi ；辅助加热气： 70psi ；碰撞气：氮气；优化后的定性定量离子对的碰撞电压、裂解电压见表1。

1.3.3 标准溶液的配制

0.1mg⋅mL^-1 混合标准溶液：移取浓度均为1.0mg⋅mL^-1 的大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚标准溶液各 1mL 加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度为 0.1mg⋅mL^-1 的混合标准物质储备液，密封， -18°C 保存备用。

100ngmL^-1 标准工作溶液：移取上述 0.1mgmL^-1 标准物质储备溶液 100μL 加入 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为 1μg⋅mL^-1 的标准物质工作溶液；移取 1μg⋅mL^-1 的标准物质工作溶液 1mL 加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀、配制成浓度为 100ng⋅mL^-1 的标准物质工作溶液，密封， -18°C 保存备用。

5ng⋅mL^-1 标准工作溶液：移取 100ng⋅mL^-1 标准物质工作溶液 500μL ，加人 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度线，配制成浓度为 5ng⋅mL^-1 的标准物质工作溶液，密封， -18°C 保存备用。