高效液相色谱法测定乌鸡中氟喹诺酮类药物残留量

Detection of Fluoroquinolone Residues in Black-Boned Chicken Using High-Performance Liquid Chromatography

HUANG Ruihong （Chongzuo Aquatic and Livestock Technical Service Center， Chongzuo 532200， China）

Abstract： A high-performance liquid chromatography （HPLC） method was established for detecting residues offourfluoroquinolones in black-boned chicken.Thechicken samples were minced，homogenized，andextracted using a phosphate bufer solution，followed by purification with solid-phase extraction columns.The analytes were then quantified via HPLC.Results showed that under optimal experimental conditions，the linear relationships for ciprofloxacin，danofloxacin，enrofloxacin，andsarafloxacin were excellent，with correlation coficients R² ） exceeding 0.999. The method demonstrated detection limits of 0.474 6μg⋅kg^-1 to 4.849μg⋅kg^-1 and quantification limits of 0.943 6μg⋅kg^-1 to 10.070μg⋅kg^-1 for the four target analytes. At three spiked concentration levels， the average recoveries of the four fluoroquinolones ranged from 80.38% to 101.70% ，with relative standard deviations between 0.46% to 1.52% .These findings indicate that the method is accurate，sensitive，and reliable，meeting the requirements for veterinary drug residue analysis.It provides a technical reference for detecting restricted and banned fluoroquinolones in animal-derived food products at the grassroots level.

Keywords： high-performance liquid chromatography （HPLC）; fluoroquinolones; black-boned chicken; drug residues

乌鸡是广西食用农产品“治违禁控药残促提升”三年行动部署中11个重点治理的品种之一，容易出现氟喹诺酮类药物残留超标。氟喹诺酮类药物是一类人工合成的广谱抗菌剂，具有高抗菌活性、低毒性以及在生物体内良好的组织渗透性，因此被广泛应用于水产养殖、家禽和牲畜的疾病防控[1]，但当药物残留进人食物链后，会给人们的健康带来潜在风险。因此，建立可行的兽药残留分析方法才能更好地开展风险监控。目前，检测鸡肉中氟喹诺酮残留的方法主要有酶联免疫吸附法、气相色谱质谱法和高效液相色谱等，其中高效液相色谱法《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法》（农业部1025号公告—14—2008）是我国现行的国家标准检测方法[2]。本文旨在开发并优化一种基于高效液相色谱的分析方法，用于定量分析乌鸡组织中4种典型氟喹诺酮类抗生素的残留量，为基层开展动物农产品中氟喹诺酮类检测技术提供了参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

乌鸡肌肉样品，广西崇左市某养殖场。乙腈、甲醇，均为色谱纯，ThermoScientific公司；磷酸，成都金山；氢氧化钠，国药集团；三乙胺、磷酸二氢钾，均为分析纯，广东光华科技；水（二级水）；盐酸环丙沙星标准品（批号：H0101310，纯度99.8% ）、甲磺酸达氟沙星标准品（批号：0201210，纯度 94.2% ）、沙拉沙星标准品（批号：H0181604，纯度 99.6% ）、恩诺沙星标准品（批号：H0081907，纯度 99.7% ），中国兽医药品监察所。

LC-20A高效液相色谱仪（配RF-20荧光检测器）、 C₁₈ 固相萃取柱，岛津；HY-5A型数显摇床，常州国华；3K15高速冷冻离心机，Sigma公司；XSR205DU分析天平、超纯水机，梅特勒；微孔滤膜（ 0.45μm ），岛津。

1.2溶液配制

1.2.1磷酸/三乙胺溶液、磷酸盐缓冲溶液和流动相的配制

① 移取浓磷酸 3.4mL ，加水稀释至 1000mL 三乙胺调节 pH 值至2.4，得到 0.05mol⋅L^-1 磷酸／三乙胺溶液。 ② 磷酸盐缓冲溶液。称取磷酸二氢钾6.8g ，加水溶解至 500mL ， 5.0mol⋅L^-1 氢氧化钠溶液调节pH值为 7.0 （204号 ③ 流动相。将 0.05molL^-1 的磷酸／三乙胺溶液与乙腈溶液以体积比为 78：22 进行混合。

1.2.2 标准系列溶液的配制

① 混合标准储备液。分别准确称取恩诺沙星、盐酸环丙沙星、沙拉沙星3种标准品各 0.025g （以主含量计）以及甲磺酸达氟沙星 0.005g （以主含量计），用 0.03mol⋅L^-1 氢氧化钠溶液充分溶解并定容至25mL ，得到浓度为 1.0mgmL^-1 的恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及 0.2mg⋅mL^-1 的达氟沙星4种混合标准储备液。 ② 混合标准工作液。准确移取混合标准储备液 2.0mL ，用乙腈定容至 100mL ，混合均匀后得到混合标准中间液，再准确吸取 5.0mL 混合标准中间液，用乙腈定容至 100mL 混合均匀后得到环丙沙星、沙拉沙星、恩诺沙星的浓度为 1.0μg⋅mL^-1 及达氟沙星的浓度为 0.2μg⋅mL^-1 的混合标准工作液。 ③ 分别准确吸取混合标准工作液50、100、200、400、 500μL 和 700μL 于 10mL 容量瓶中，用流动相准确定容得到环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星浓度梯度为 5，10，20，40，50ngmL^-1 和 70ng⋅mL^-1 及达氟沙星浓度梯度为1、2、4、8、10ng⋅mL^-1 和 14ng⋅mL^-1 标准系列溶液。

1.3样品前处理

① 乌鸡肉样品处理。取出栏乌鸡肉样品，绞碎后均质，装入样品瓶中备用。 ② 提取。准确称取0 2.00±0.05 ）g样品于 50mL 离心管中，加入 10mL 磷酸盐缓冲溶液，涡旋混合 2min ，于 300r⋅min^-1 振荡 10min ， 10 000r⋅min^-1 离心 5min ；收集上清液至新离心管，残渣重复提取1次，合并两次提取液并充分混匀， 10 000r⋅min^-1 离心 5min ，即得样品液，待用。 ③ 净化。依次用 2mL 甲醇和 2mL 磷酸盐缓冲溶液活化固相萃取柱，取 5.0mL 制备的样品液过柱， 1mL 流动相洗脱并挤干，收集洗脱液，经 0.45μm 微孔滤膜过滤后进样分析。

1.4检测条件

色谱柱： C₁₈ （ 250mm×4.6mm ， 5μm ）；荧光检测器参数设置为激发波长 280nm/ 发射波长 465nm 色谱柱恒温 30^qC ，流动相流速 0.8mL⋅min^-1 ，进样体积 20μL 。

2 结果与分析

2.14种氟喹诺酮类药物的色谱图

由图1、图2可知，4种氟喹诺酮类药物峰型较好，且分离完全，保留时间处无明显干扰峰出现。

2.2 线性范围

由表1可知，环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星在质量浓度为 5～70ng⋅mL^-1 ，达氟沙星在质量浓度为 1～14ng⋅mL^-1 时， R² 均 >0.999 ，说明线性关系良好。

2.3 灵敏度检测

样品空白独立测试11次，计算检测结果的标准偏差（S），检出限为样品空白平均值 +3S 的检测浓度，定量限为样品空白平均值 +10S 的检测浓度。结果显示，达氟沙星方法检出限为 0.474 6μg⋅kg^-1 定量限为 0.943 6μg⋅kg^-1 ；环丙沙星方法检出限为4.849μg⋅kg^-1 ，定量限为 10.070μg⋅kg^-1 ；恩诺沙星方法检出限为 2.332μg⋅kg^-1 ，定量限为 4.178μg⋅kg^-1 ：沙拉沙星方法检出限为 2.193μg⋅kg^-1 ，定量限为（204号 。

2.4 回收率和精密度

称取同一阴性样品若干份，4种药物分别添加3个水平，每个添加水平做3个平行样。由表2可知，4种氟喹诺酮类药物的加标回收率为 80.38% ＼～101.70% ，相对标准偏差为 0.46%～1.52% 。说明该检测方法回收率稳定，精密度能满足检测要求。

3结论与讨论

与普通肉鸡不同，乌鸡的消化道、气管、肌肉、肠系膜和骨膜等多个器官含有黑色素，对氟喹诺酮类药物的代谢慢[3]。氟喹诺酮类药物易与黑色素结合，恩诺沙星药物对于乌鸡肌肉、皮脂黑色素含量高的组织需要更长的休药期[4-6。现有关于恩诺沙星等药物在鸡体内代谢的研究数据主要来源于白羽肉鸡模型，在乌鸡中有适用局限性。

本研究采用高效液相色谱法测定乌鸡中4种典型氟喹诺酮类兽药残留，乌鸡中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星药物含量线性回归方程 R² 均大于 0.999 ；4种药物的方法检出限为 0.4746～4.849μg⋅kg^-1 ，定量限为 0.9436～ 10.070μg⋅kg^-1 ，在3个添加量水平下，4种药物的平均回收率为 80.38%～ 101.70% ，相对标准偏差为0.46%～1.52% 。结果表明，该方法的准确度高、灵敏度佳、稳定性好，为基层农产品质量安全中氟喹诺酮类药物残留的日常检测工作提供质量控制参考。

参考文献

[1]朱莉萍，朱涛，武娜，等.高效液相色谱法测定猪肉中氟喹诺酮类药物[J].肉类研究，2011，25（10）：29-31.

[2]中华人民共和国农业部.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法：农业部1025号公告—14—2008[S].北京：中国农业出版社，2008.

[3]张璐，巩忠福，张玉洁，等.乌鸡中氟喹诺酮类药物残留现状分析[J].中国兽药杂志，2023，57（10）：79-82.

[4]赵琳，张大文，张瑞英，等.恩诺沙星在余干乌鸡不同组织中的残留消除规律研究[J食品安全质量检测学报，2022，13（4）：1327-1333.

[5]ONOC，TANAKAM.Bindingcharacteristiesof fluoroquinosynthetie to synthetic levodopa melanin[J].J Pham Pharmacol，2003，55（8）：1127-1133.

[6]高志存，石露莎，余舒宁，等.动物源性食品中8种氟喹诺酮类药物多残留高效液相色谱检测方法的建立[J]中国动物检疫，2023，40（7）：116-120