食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法应用分析

摘 要：目的：对熟肉制品、速冻调理肉、速冻水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品和乳制品6类食品开展单核细胞增生李斯特氏菌检测，总结试验注意事项，评估病原菌污染风险，为食品质量监控提供依据。方法：依据国家标准对样品进行增菌、分离、初筛、鉴定，计算检出率。结果：速冻调理肉、速冻水产制品、冷冻饮品3类食品均检出单核细胞增生李斯特氏菌，其中冷冻饮品检出率最高。结论：冷冻食品有单核细胞增生李斯特氏菌污染风险；选择合适的检测方法监控病原菌，可降低单核细胞增生李斯特氏菌食品污染发生概率，保障食品安全。

关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；培养；检测；检出率

Application Analysis of Detection Methods for Listeria monocytogenes in Food

ZHU Shiyu， REN Guanda， GUO Xu， ZHAO Ziyi

（Shenyang Market Regulatory Affairs Service Center （Shenyang Product Quality Supervision and Inspection Institute）， Shenyang 110022， China）

Abstract： Objective： To detect Listeria monocytogenes in cooked meat products， quick-frozen prepared meat， quick-frozen aquatic products， ready-to-eat fruit and vegetable products， frozen drinks and dairy products. Summarize the precautions of the test， assess the risk of pathogen contamination， to provide the basis for food quality control. Method： According to the national standard， the samples were increased， separated， screened， identified and calculate the detection rate. Result： Listeria monocytogenes were detected in frozen prepared meat， frozen aquatic products and frozen drinks. The detection rate of frozen drinks was the highest. Conclusion： Frozen food has the risk of Listeria monocytogenes contamination. Select the appropriate test method to monitor the pathogen， reduce the probability of Listeria monocytogenes contaminating food， ensure food safety.

Keywords： Listeria monocytogenes; cultivate; detection; detection rate

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）在自然界普遍存在，如土壤、植物、地表水等。该菌属于一种人畜共患病的病原菌，动物和人摄入受污染的水或食物感染该细菌后会引发疾病。通常情况下，LM是革兰氏阳性嗜冷杆菌，具有较强的生长繁殖能力，在4～45 ℃环境中均可以生长繁殖，污染环境的风险较高[1]。生活环境中存在LM污染会大幅提升人类感染患病风险，免疫力低下的人群如老人、婴幼儿是该菌的易感染人群。LM可突破肠道、血脑和胎盘屏障，引发机体肠道炎、脑膜炎，甚至导致孕妇流产，现已被列为食品主要致病菌之一[2]。因此，重视对LM污染的监控，借助快速检验方法对食品中LM开展检验，对于保护消费者生命健康、保障公共卫生具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

随机选取不同区域的食品消费场所的熟肉制品、速冻调理肉、速冻水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品、乳制品6类食品产品。菌种：单增李斯特氏菌（编号ATCC 19111）、伊氏李斯特氏菌（编号ATCC 19119）、斯氏李斯特氏菌（编号ATCC 35967）、英诺克李斯特氏菌（编号ATCC 33090）、马红球菌（编号ATCC 6939）和金黄色葡萄球菌（编号ATCC 25923）。

酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤、酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂、血琼脂培养基、李氏增菌肉汤、PALCAM琼脂、李斯特氏菌显色培养基、SIM动力培养基和生化鉴定试剂盒，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

LE2002E电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UBM-400拍击式均质器，北京优晟联合科技有限公司；BF-115生化培养箱，德国宾得科技公司；CI-L生物显微镜，日本尼康科技公司；A2-1379生物安全柜，美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 检验方法

（1）增菌。依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）对样品进行增菌，以无菌操作选择25 g（mL）待检测样品和25 mL李斯特质控菌种菌液分别将其置于225 mL LB1培养液中，混匀，将其置于（30±1） ℃培养18～24 h，取培养液0.1 mL置于10 mL LB2培养液中，混匀，置于（30±1）℃培养18～24 h。

（2）分离。依据GB 4789.30—2016分离污染菌，取上述样品和质控菌种培养液，接种于PALCAM培养基和LM显色琼脂培养基。将其置于（36±1）℃培养24～48 h。

（3）初筛。依据GB 4789.30—2016纯培养可疑目标菌，将可疑目标菌和质控菌种接种到酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂培养基，置于（36±1）℃培养18～24 h。同时接种鼠李糖发酵培养基和木糖发酵培养基，置于（36±1）℃培养18～24 h。

（4）鉴定。依据GB 4789.30—2016对可疑目标菌和质控菌种开展鉴定试验，将上述培养物接种到SIM动力培养基中于（25±1）℃培养24～48 h。同时接种到生化试剂培养基（MR、VP、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、七叶苷）中，将其放置在（36±1）℃环境下培养24～48 h，观察反应现象。将上述培养物接种到血琼脂平板上，在平板的底部位置分隔出多个小格，在各个小格中引入一种菌落，置于（36±1）℃培养24～48 h。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

阳性样品和LM质控菌种镜检为革兰氏阳性菌，有动力生长现象，鉴定结果如表1所示。其中鼠李糖黄色为阳性，绿色为阴性；木糖黄色为阳性，绿色为阴性；MR红色为阳性，无色为阴性；VP红色为阳性，无色为阴性；葡萄糖黄色为阳性，绿色为阴性；麦芽糖黄色为阳性，绿色为阴性；甘露醇黄色为阳性，绿色为阴性；七叶苷黑色为阳性，无色为阴性。通过反应颜色判定阳性样品和LM质控菌种显示出鼠李糖阳性、木糖阴性、MR阳性、VP阳性、葡萄糖阳性、麦芽糖阳性、甘露醇阴性及七叶苷阳性，且溶血试验未出现明显溶血现象，将符合此鉴定结果的样品判定为阳性检出。在鉴定检测中为了获得良好鉴定效果，选择应用商品化生化试剂盒开展检验，操作方便，可减少检验时间。在试验过程中与质控菌种鉴定对比，防止非目标菌的干扰。

2.2 样品检出率

通过以上鉴定方法对2021—2023年抽取的472份

食品样品进行LM检验，结果显示阳性样品共5份，检出率为1.06%。各年份检出情况如表2所示。

472份样品分为熟肉制品、速冻调理肉、速冻水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品和乳制品，各类别检验出情况如表3所示。冷冻饮品检出率最高，达到1.82%，其余依次为速冻水产制品（1.72%）、速冻调理肉（1.64%），熟肉制品、即食果蔬制品和乳制品未检出LM。

3 结论与讨论

LM在食品致病菌检验中属于较为常见的指标，2021—2023年随机选取的472份6类食品样品中，LM平均检出率为1.06%，说明食品产品存在LM污染风险。其中，冷冻饮品检出率为1.82%，在6类食品中检出率最高，其次为速冻水产制品和速冻调理肉，检出率分别为1.72%和1.64%。LM病原菌即便在低温、高渗环境下也能够生长繁殖，所以冷冻不能抑制LM生长，LM在冷冻食品中检出率较高。因此，食品冷冻储存方式存在病原菌污染风险，在食品流通领域不能过度依赖食品的冷冻储存方式，应定期对冷冻设备进行清洗消毒，监控冷冻设备病原菌污染情况，在冷冻食品检验中要更加关注LM污染情况。

在对样品开展LM检测时，发现增菌环节有混浊现象，说明样品中有污染菌。食品样品往往受多种细菌污染，为有效检出目标菌，在增菌环节要注意选择适合的培养基排除干扰菌。LB培养液中加入吖啶黄以及萘啶酮酸2种试剂，对细菌脱氧核苷酸有一定抑制作用，可减少革兰氏阴性菌的增殖[3]，LM在此营养条件下低温培养可有效繁殖，有良好增菌效果。在增菌检验时，要注意培养基配制，防止过度热处理影响培养基营养成分，添加上述2种试剂时要注意避光操作，添加时防止液体溅出，防止出现气溶胶对环境和人员造成污染和伤害。在二次增菌时，取0.1 mL增菌液，注意增菌液完全混匀，确保增菌液培养的均匀性，防止出现漏检问题。在分离环节，典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈；在显色琼脂培养基上为蓝绿颜色菌落，周边存在白色晕圈。应用显色琼脂培养基分离目标菌种，较普通培养基更加便捷有效。在分离检验时，分离琼脂培养基应现用现配，确保培养时间足够满足细菌生长要求，注重分离单个菌落，辨别菌落形态颜色，与质控菌种做对照，防止带入杂菌和出现漏检的情况。根据菌体抗原类型可将LM分为多个血清型，不同血清型的毒力、致病性不同，LM致病性强的血清型与其他细菌有重合抗原，因此鉴定血清型对分辨LM致病性没有意义，反而通过生化反应鉴定LM更准确。在生化鉴定环节，鼠李糖发酵和木糖发酵是初筛生化反应，要注意辨别发酵反应的颜色，在鉴定检验时要应用生化试剂盒，注意接种菌悬液浓度为0.5麦氏浊度防止出现假阳性。应用生化试剂盒进行检验可节省配制培养基的时间，更加快速地鉴别细菌。此外，随着科技的发展，目前利用分子生物学技术鉴定LM病原菌已得到普及。通过分析病原菌的actA基因序列，进行引物和RPA探针设计，进而应用PCR分子生物学技术开展病原菌检测[4]。此方法鉴定结果更准确，但操作过程有分子生物污染风险，并且步骤烦琐，不便于常规筛查食品中LM污染情况，而应用荧光定量PCR技术可规避分子生物学污染问题，并实现LM的定量分析[5]。

综上所述，相关监管部门和食品生产企业应选择高效、准确的检测技术开展食品和环境中LM检测工作，关注冷冻食品LM的风险监测，对食品污染情况进行评估，及时找出影响食品安全的因素，保证食品市场健康发展。

参考文献

[1]余琪，吴忠红，谭慧林.食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验探讨[J].现代食品，2020（10）：146-147.

[2]王福.单核细胞增生李斯特菌研究进展[J].口岸卫生控制，2011，16（5）：50-53.

[3]王海艳，刘中学，刘虹，等.干奶粉中单增李斯特氏菌的生存评估[J].检验检疫科学，2008（4）：19-22.

[4]郭正洋，陈晶，刘小青，等.单核细胞增生李斯特氏菌荧光RPA快速检测方法的建立[J].基因组学与应用生物学，2020，39（12）：5599-5605.

[5]王小红.荧光定量PCR技术研究进展[J].国外医学（分子生物学分册），2001（1）：42-45.