高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中的甲硝唑和地美硝唑

摘 要：目的：建立高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中甲硝唑和地美硝唑残留的方法。方法：样品依次用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，混合阳离子交换固相萃取柱净化后，使用Shimadzu VP-ODS C18色谱柱分离，以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相进行洗脱，多反应监测正离子扫描，外标法定量。结果：甲硝唑和地美硝唑的质量浓度在0～400 μg·L-1时线性关系良好，检出限和定量限分别为0.5 μg·kg-1和1.0 μg·kg-1。在0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1 3个加标水平下，精密度和加标回收率均符合要求。结论：该方法前处理简单、重现性好、回收率高，适用于大批量鸡蛋中甲硝唑、地美硝唑残留的测定。

关键词：高效液相色谱-串联质谱法；鸡蛋；甲硝唑；地美硝唑

Determination of Metronidazole and Dimenidazole in Eggs by High-Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry

LU Wei， ZUO Wenjing， DING Shihua

（Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center， Baoji 721000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of metronidazole and dimenidazole in eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The samples were extracted with ethyl acetate， degreased with n-hexane， and cleaned up with a mixed cation exchange solid phase extraction column. The samples were separated on a Shimadzu VP-ODS C18 column with 0.1% formic acid water and 0.1% formic acid acetonitrile as the mobile phases. Multiple reaction monitoring positive ion scanning and external standard method were used for quantification. Result： The linear relationship between metronidazole and dimenidazole was good in the range of 0～400 μg·L-1， and the limits of detection and quantification were 0.5 μg·kg-1 and 1.0 μg·kg-1， respectively. At the three spiked levels of 0.5 μg·kg-1， 1.0 μg·kg-1， and 5.0 μg·kg-1， the precision and spiked recovery rates met the requirements. Conclusion： This method has simple pretreatment， good reproducibility， and high recovery rate， and is suitable for the determination of metronidazole and dimenidazole in large quantities of eggs.

Keywords： high-performance liquid chromatography mass spectrometry; eggs; metronidazole; dimenidazole

甲硝唑、地美硝唑属于人工合成的硝基咪唑类药物，对鸡生殖系统疾病、肠道和组织的厌氧菌感染、家禽的滴虫病感染等有较好的疗效[1]。同时，此类药物可作为牛、猪、禽的生长促进剂，能提高饲料转化率[2]。硝基咪唑类药物及其代谢产物进入动物体内会有不同程度的残留，而这些动物性食品进入人体后，可能引起细胞诱变和遗传毒性作用，从而影响人体健康[3]。欧盟和美国将二者列为禁用兽药，而日本规定二者不得在食品中检出[4]。我国制定的《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定允许二者作治疗用兽药，但在动物源性食品中不得检出[5]。

鸡蛋含有丰富的蛋白质、脂肪、卵磷脂等营养成分，因此一直以来都是居民日常饮食中的重要组成部分。我国目前制定和发布的硝基咪唑类药物检测方法标准中只有《动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》（SN/T 2624—2010）有针对鸡蛋的前处理方法，但提取过程需要反复转移样液，旋转蒸发，并且使用两种固相萃取柱净化，步骤较复杂，回收率低。本实验旨在确保回收率的前提下，寻找一种简便的前处理方式，使其适于检测大批量样品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售鸡蛋，去壳后均质，-18 ℃以下保存。

甲醇、正己烷、乙腈（色谱纯），DIKMA；甲酸（色谱纯），天津市大茂化学试剂厂；乙酸乙酯（色谱纯），Knowles诺尔施；浓盐酸，四川西陇科学有限公司；氨水，天津北联；甲硝唑有证标准物质，浓度99.3%，TM Standard；地美硝唑有证标准物质，浓度99.9%，TM Standard；实验用一级水；Agela混合阳离子交换固相萃取柱，60 mg，3 mL。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱/质谱仪：ESI源，美国赛默飞科技有限公司；SQP Practum224-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；VG3涡旋混匀器，IKA；TG16-WS离心机，湖南沪康离心机有限公司；MTN-2800D氮吹仪，天津奥特塞思斯仪器有限公司。

1.3 液相色谱-质谱/质谱条件

（1）液相色谱条件。LC-30AD系统；流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈溶液；色谱柱：Shimadzu VP-ODS C18（150 mm×2.0 mm，4.6 μm）；柱温：35 ℃；流速：0.30 mL·min-1；进样体积：2 μL；洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1。

（2）质谱条件。LCMS-8030系统；扫描模式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；离子源：ESI+；离子源接口电压：4.5 kV；干燥气：N2（流量15 L·min-1）；雾化气：N2（流量3.0 L·min-1）；碰撞气：Ar；加热模块温度：400 ℃；脱溶剂管温度：200 ℃；驻留时间：100 ms；延迟时间：3 ms。

1.4 样品前处理

称取2 g（准确至0.1 mg）试样于50 mL离心管中，加入15 mL乙酸乙酯，旋涡混匀2 min，10 000 r·min-1离心5 min。取上清液于另一50 mL离心管中，残渣中加入15 mL乙酸乙酯，重复提取一次，将两次提取液合并于25 ℃氮吹干。残余物中加0.1 mol·L-1盐酸溶液5 mL，旋涡1 min充分溶解，加入正己烷5 mL，振摇1 min，5 000 r·min-1离心5 min，弃正己烷层。下层再加5 mL正己烷重复除脂一次，弃正己烷层，备用。

依次用甲醇2 mL和0.1 mol·L-1盐酸溶液2 mL活化固相萃取柱，取备用液过柱，依次用0.1 mol·L-1盐酸溶液2 mL、甲醇1 mL和2%氨水1 mL淋洗，2 mL洗脱液洗脱。收集洗脱液，35 ℃氮吹干，加水1 mL，涡旋1 min，滤膜过滤，供测定。取空白试料，除不加药物外，同上步骤处理。

1.5 标准溶液的配制

称取甲硝唑和地美硝唑标准品各10 mg，用甲醇溶解并稀释定容，分别配制成1 mg·mL-1的标准储备液。吸取上述储备液各10 μL，用甲醇分别定容至10 mL，配制成1 μg·mL-1的标准工作液。取经上述提取和净化的空白试料溶液，分别加入适量的标准工作液，35 ℃氮吹干，加水1 mL，涡旋1 min，配制成浓度为0 μg·L-1、2 μg·L-1、4 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、200 μg·L-1和400 μg·L-1的基质标曲溶液并上机测定。

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

在正离子扫描和MRM模式下，多次测定100 ng·mL-1的甲硝唑和地美硝唑标准溶液，对质谱参数进行优化，结果见表2。选择稳定性好、干扰小、相对离子丰度高的碎片离子作为定量离子和定性离子，并以响应值最高、丰度最强的离子对作为定量离子对。定量离子的MRM图见图1，特征离子扫描质谱图见图2。

2.1.2 液相条件的优化

试验对比了以下3组流动相组合：①甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵溶液；②0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸2 mmol·L-1乙酸铵水溶液+甲醇（95+5）；③0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈。其中，第3组流动相组合响应值最好，且出峰效果最佳，因此选择0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相进行洗脱。

2.2 提取条件的选择和优化

甲硝唑和地美硝唑在乙酸乙酯和乙腈中具有较好的溶解性。鸡蛋中加入乙腈后，易形成果冻状物质，影响提取效果。而加入乙酸乙酯后可较好地提取目标物质，离心后正己烷除脂，通过混合阳离子交换固相萃取柱净化去除杂质干扰。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系

用空白基质按照上述方法处理，配制相应的基质标曲溶液上机测定，以峰面积对浓度进行线性回归，甲硝唑的线性回归方程为f（x）=0.498 004x，相关系数R2=0.999 3；地美硝唑的线性回归方程为f（x）=360.416x，相关系数R2=0.999 2。结果表明，二者在0～400 μg·L-1都呈现良好的线性关系。

2.3.2 检出限和定量限

准确称取11份阴性样品，加入一定浓度的标准溶液，按照上述方法处理，检出限为信噪比≥3时的浓度，定量限为信噪比≥10时的浓度，得到甲硝唑和地美硝唑的检出限均为0.5 μg·kg-1，定量限均为1.0 μg·kg-1。

2.3.3 精密度和回收率

称取阴性样品，按照0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1和5.0 μg·kg-1 3个水平分别加入相应的标准工作液适量，按照上述方法处理，每个水平重复测定6次，精密度和加标回收率测定结果见表3。结果表明，甲硝唑和地美硝唑的精密度和加标回收率均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求。

2.3.4 实际样品测定

为了进一步验证方法的有效性，选择市售的多批鸡蛋样品进行检测，测定回收率在82.1%～103.2%，相比于SN/T 2624—2010的前处理方法，此方法前处理高效简便，提高了提取效率，适用于检测大批量样品。

3 结论

本文建立了检测鸡蛋中甲硝唑和地美硝唑的方法。本方法线性良好，前处理方法较SN/T 2624—2010中的方法简单，回收率高，可应用于大批量食品检测。后续还将继续研究，将此方法应用于其他基质中硝基咪唑类药物残留的检测。

参考文献

[1]杜乐，喻世静，殷智鑫，等.硝基咪唑类药物的研究进展[J].化学世界，2020，61（2）：92-98.

[2]郭礼强，张金玲，李凯，等.HPLC-MS/MS法测定饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量[J].中国兽药杂志，2017，51（1）：52-56.

[3]陈培荣，刘锦妮，李洵，等.饲料中硝基咪唑类药物的GC-MS检测方法[J].江苏农业科学，2013，41（7）：292-293.

[4]李锐，钱鸣蓉，肖英平，等.国内外水禽产品中兽药残留限量标准比对分析[J].农产品质量与安全，2017（6）：28-31.

[5]农业农村部，国家卫生健康委员会.食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量：GB 31650—2019[S].北京：中国标准出版社，2019.