一例菌落总数测量审核的回顾与分析

摘 要：目的：借助测量审核提高本实验室检测水平和核心竞争力。方法：以中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供的作业指导书为依据，采用平板计数法和测试片法分别对样品进行检测。结果：配对t检验显示两种方法的检测结果不具有显著性差异（P＞0.05），两种方法的|Z|值均小于2，为满意结果。结论：平板计数法和测试片法均可用于菌落总数的检测，检测机构可以依据自身条件选择合适的方法来检测样品中的菌落总数。

关键词：菌落总数；测量审核；测试片

Review and Analysis of a Case of Total Bacterial Count Measurement Audit

SUN Tianjiao1， YANG Hongyin1， ZHANG Weiying2， DING Shuying1， YIN Yanbai1

（1.Jining Institute of Quality Metrology Inspection （Jining Semiconductor and Display Product Quality Supervision and Inspection Center， Jining Fiber Quality Monitoring Center）， Jining 272000， China; 2.Jining Institute for Food and Drug Control， Jining 272000， China）

Abstract： Objective： To improve the testing level and core competitiveness of this laboratory with the help of measurement audit. Method： Based on the operation instructions provided by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine， the samples were tested using the plate counting method and the test piece method. Result： The paired t test showed that there was no significant difference in the detection results of the two methods （P>0.05）. The |Z| values of the two methods were both less than 2， which was a satisfactory result. Conclusion： Both the plate counting method and the test piece method can be used to detect the total number of bacterial colonies. Testing institutions can choose the appropriate method to detect the total number of bacterial colonies in the sample based on their own conditions.

Keywords： total bacterial count; measurement audit; test piece

测量审核是实验室向中国合格评定国家认可委员会认可的机构申请购买标准样品，然后检测样品的某些项目，将检测结果反馈给机构，比较检测结果与参考值，依据比较结果来判断实验室检测水平的一种活动[1]。它与能力验证一样都是实验室控制质量的方法，参加这类活动可以使检验人员得到锻炼，控制实验室检测质量，从而提升实验室检测能力。检测机构有权利也有义务参加测量审核和能力验证。

菌落总数是样品被稀释到一定程度后与培养基混匀，在经过适宜的条件培养后，每克或每毫升样品中长出肉眼可见的菌落总数[2]。菌落总数常被称为需养菌数或杂菌数，是因为有些厌氧、微需氧菌或是需特殊营养的细菌等无法生长，生长出的菌落也无法分辨种类，但菌落总数可以作为一个初步判定产品质量的指标。当前检测菌落总数的方法主要有平板计数法、滤膜法、纸片法等[3]。本文采用平板计数法和测试片法分别检测同一冻干粉（模拟食品）的菌落总数，以配对t检验法比较两种方法检测结果的差异性。本研究可以指导本实验室日后菌落总数的检测工作，也可为其他检测机构检测食品、食品接触材料、一次性餐饮具以及生活用纸中菌落总数提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

标准样品购自中国检验检疫科学研究院测试评价中心，外观呈白色冻干粉状，保存于真空西林瓶内，编号为MA-FD-001；营养琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）；PetrifilmTM细菌菌落总数测试片（3M中国有限公司）。

BOXUN压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；ZVL IUL均质器（上海德记行科技发展有限公司）；BSC-1100B2-Z生物洁净安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；SPX-100B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 检验依据

参照中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供的《测量审核作业指导书》（ACAS-TR710-06-03/00）对样品进行前处理，以平板计数法为依据，测试片法作为对比方法，分别检测样品。

1.3 试验方法

1.3.1 检测样品制备

参照样品携带的《测量审核作业指导书》，准备约60 mL灭菌稀释液（灭菌生理盐水），对收到处于高真空状态下的冻干样品进行再水化。具体操作如下：在无菌环境下，样品放置室温后，小心地开启西林瓶，防止样品飞溅出；开启西林瓶后，立刻加5 mL灭菌生理盐水再水化；轻微振荡溶解后，用移液枪转移至无菌瓶中，反复多次用剩余的55 mL灭菌生理盐水冲洗西林瓶内壁，清洗液合并放入上述无菌瓶中，得到的溶液就等同于60 mL的食品样品，称为样品原液。

1.3.2 样品的稀释

先用移液枪分别转移9 mL的灭菌生理盐水于5个无菌试管中，再转移1 mL样品原液缓缓加入一支试管中，振荡使溶液混匀，稀释成10-1的样品匀液，然后再逐步稀释制备10-2～10-5的样品匀液。

1.3.3 平板计数法

依据国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）中平板计数法对1.3.2中的样品匀液进行检测。从100～10-5的样品匀液中各移取1 mL样品，分别加入琼脂平板中，轻轻转动混匀，待琼脂凝固，倒置于36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。每个稀释度样品匀液接种2个平板，同时做空白对照。

1.3.4 测试片法

依据测试片的操作说明对1.3.2中的样品匀液进行检测。从100～10-5的样品匀液中各移取1 mL样品，分别加入PetrifilmTM细菌菌落总数测试片中，加完样品后缓慢盖好上膜，可用压板去除可能产生的气泡，待样品完全吸收后，将测试片透明面向上置于培养箱36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。每个稀释度做2张测试片，同时做空白对照。

1.3.5 菌落总数计数

平板计数法采用目视法计数，为了方便统计，可在平板上划十字区，用记号笔逐个点黑点统计各个区的菌落数，4个区之和乘以稀释倍数即为菌落总数。

PetrifilmTM细菌菌落总数测试片中含有的指示剂可使菌落显示红色，且自带计数网格，方便计数，计数时计算所有红色菌落。

1.3.6 数据处理

采用平板计数法和测试片法同时检测样品，平行重复10次，借助统计学软件采用t配对检验对两组数据进行比对分析，P＜0.05为数据有显著差异。

2 结果与分析

对平板计数法和测试片法10次检测结果取平均值，作为最终检测结果，对比结果详见表1。对两种方法的检测结果开展配对t检验，结果见表2。

由表2可知，平板计数法和测试片法的检测结果无显著性差异（P＞ 0.05），均值分别为4 080 CFU·mL-1和4 100 CFU·mL-1。国家标准GB 4789.2—2022[4]规定，当菌落总数≥100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约，采用2位有效数字，后面用0代替位数，因此两种方法的报告值均为4 100 CFU·mL-1。标准差分别是78.88 CFU·mL-1和81.65 CFU·mL-1，均值的标准误差分别为24.94 CFU·mL-1和25.82 CFU·mL-1，说明两种方法的检测结果波动不大，有较好的重现性。

3 结论

研究表明，平板计数法和测试片法检测冻干粉（模拟食品）中菌落总数不存在显著差异，原因可能在于试验条件（接种量、培养温度、培养时间、仪器设备）相同，且是同一实验员在相同环境下操作，不影响微生物生长和试验结果[5]。实验过程中需注意，样品的稀释度一定要合适，避免出现样品浓度太高，菌落总数太大的情况。平板计数法接种时，培养基温度不能过高，样品匀液与培养基应充分混匀，防止菌落生长成团无法计数。培养期间应关注菌落生长状态，切勿等到培养时间结束再去计数，防止菌落生长太大蔓延到一起导致计数结果不准确。最终结果以在30～300 CFU的平板菌落数为准，也可依据其他浓度的菌落数结果来佐证落在此范围内平板的计数结果。

平板计数法和测试片法各有利弊，平板计数法需要提前配制琼脂培养基、灭菌、烘干等，有时还要采取措施防止菌落蔓延。PetrifilmTM测试片内含红色指示染剂，可使菌落呈红色便于计数，没有复杂的前期准备工作，节约时间，操作快捷，效率高，且检测数据准确可靠，缺点是成本高，检测机构可根据自身实际情况选择检测方法。

开展测量审核活动可评价实验室检测水平，有助于实验室发现自身问题，提高检测人员的检测能力。本次检测结果上报后反馈Z值为-0.1，按照中国检验检疫科学研究院测试评价中心指定的评价标准，|Z|≤2.0为满意结果，这表明本实验室检测菌落总数结果可靠。

参考文献

[1]杨俊业，黄玲玲.大肠菌群测量审核结果与分析[J].食品安全质量检测学报，2019，10（14）：4718-4721.

[2]刘芳，杨平，李传礼.菌落总数能力验证样品均匀性和稳定性[J].食品安全质量检测学报，2015，6（11）：4652-4658.

[3]王忠东，于建焕.食品卫生微生物学检验菌落总数测定方法的效果分析[J].临床医药文献电子杂志，2015（20）：4285-4286.

[4]国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定：GB 4789.2—2022[S].北京：中国标准出版社，2022.

[5]周永.微生物检验结果的主要影响因素及质量控制策略研究[J].临床检验杂志（电子版），2018，7（4）：721-722.