食品中沙门氏菌检测能力验证的结果与分析

摘 要：鉴于沙门氏菌感染案例的持续攀升，食品安全领域面临的挑战也愈发严峻，引发广泛关注。提高沙门氏菌检验能力是提升食品安全水平的重要途径之一。本实验室积极参与了中国检验检疫科学研究院测试评价中心主导执行的ACAS-PT-1616冻干乳粉中沙门氏菌检验能力验证，按照其项目要求，根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）和《进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光PCR法》（SN/T 2415—2010）的试验方法对样品进行检验。检验结果显示此次能力验证的2个样品均为沙门氏菌阳性，且获得满意结果。通过此次能力验证，本实验室在沙门氏菌检测方面的专业能力得到了显著提升。

关键词：沙门氏菌；能力验证；检验方法

Proficiency Testing Results and Analysis of Salmonella in Food

WEI Ya， XU Hong

（Anhui Guoke Testing Technology Co.， Ltd.， Hefei 230041， China）

Abstract： Given the continuous rise in Salmonella infection cases， the challenges facing the food safety sector have become increasingly severe. Improving the ability of detect Salmonella is one of the important methods to enhance food safety. Our laboratory participated in the ACAS-PT-1616 Salmonella testing capability validation activity in milk powder implemented by the Testing and Evaluation Center of the China Academy of Inspection and Quarantine， according to its project requirements， GB 4789.4—2016 and SN/T 2415—2010 were used for testing. The test results showed that both samples for this proficiency test were positive for Salmonella， and satisfactory results were obtained. Through this proficiency test， the laboratory’s professional capabilities in Salmonella detection have been significantly improved.

Keywords： Salmonella; proficiency testing; detection methods

作为一种危害性极大的食源性致病菌，在细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的中毒事件占比高达80%[1]。人类感染沙门氏菌能够引发肠胃炎、伤寒、败血症、脑膜炎，甚至死亡[2]。现今，已发现的沙门氏菌血清型有2 600多种[3]，常存在于生肉制品、水产品、乳制品、冷冻食品、禽蛋和蔬菜水果中，且能够存活数月之久[4]，对食品安全、畜牧养殖业及公众健康构成了严峻挑战。

在我国，由沙门氏菌引起的食物中毒甚至群体性食物中毒事件常有报道[5-7]。因此，提升沙门氏菌的检测能力，是防控食源性疾病和保障食品安全的重要途径。能力验证作为重要的外部质量评价活动，可长期有效监控微生物检验能力及衡量实验室的技术能力，保障检验结果的准确度和可信度。

此次参与中国检验检疫科学研究院测试评价中心主导执行的ACAS-PT-1616乳粉中沙门氏菌的检测能力验证，根据中心的项目要求，本实验室采用《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）[8]和《进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光PCR法》（SN/T 2415—2010）[9]两种检测方法进行试验，并最终取得了满意的结果。分析对比两种检测方法的检测过程及结果，优化实验操作技术，可显著提升实验室沙门氏菌检验水平。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

两组由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供的编号为23-J116和23-H756的冻干乳粉样品。

肠沙门氏菌肠亚种CICC21513（阳性对照）、大肠埃希氏菌CICC25012（阴性对照），中国工业微生物菌种保藏管理中心；缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫酸钠黄绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、沙门氏菌显色培养基和营养琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司；沙门氏菌属诊断血清A-F多价O血清、Vi抗原，宁波天润生物药业有限公司；DNA提取试剂盒、rTaq酶，宝生物工程（大连）有限公司；引物P1为5’-GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA-3’，引物P2为5’-CGTTCGGGCAATTCATTA-3’，引物T为5’-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-TAMARA-3’，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工作菌株制备

取磁珠保存的阳性对照菌株和阴性对照菌株，分别划线接种于制备好的营养琼脂平板中，置于36 ℃倒置培养24 h，待用。

1.2.2 样品处理

样品需要用60 mL无菌生理盐水进行再水化。在生物安全柜中无菌开启西林瓶，立即加入5 mL无菌生理盐水进行再水化，待溶解后，吸入无菌瓶中，再用剩余的无菌生理盐水反复清洗西林瓶内壁，回收洗液并入上述无菌瓶中。

1.2.3 GB 4789.4—2016方法

（1）预增菌。无菌操作取25 mL样品，置于225 mL BPW培养液中，振荡混匀后，36 ℃培养18 h，以25 mL无菌生理盐水为空白对照。用接种环沾取阳性对照菌株和阴性对照菌株的单菌落，置于225 mL BPW培养液中，振荡混匀后，于36 ℃培养18 h。

（2）增菌。轻摇混匀预增菌后的培养物，分别移取1 mL转接于10 mL SC和10 mL TTB培养液内。SC培养液于36 ℃培养24 h，TTB培养液于42 ℃培养24 h。

（3）分离。用接种环取增菌后的培养物1环，划线接种于沙门显色培养基平板、XLD平板和BS平板，于36 ℃分别培养24 h（BS平板培养 48 h）。

（4）生化鉴定。将可疑菌落划线接种于营养琼脂平板中，36 ℃培养24 h。取单菌落接种三糖铁琼脂斜面，先在斜面划线，再于底层穿刺，36 ℃培养24 h。同时挑取营养琼脂平板上的新鲜培养物至无菌生理盐水中，仔细研磨制成0.5个麦氏浊度的菌悬液，用此菌悬液进行尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、靛基质、甘露醇、山梨醇和ONPG试验，36 ℃培养24 h后观察结果。如果氰化钾试验呈阴性，可将时间延长至48 h，再观察结果。

（5）血清学鉴定。取营养琼脂中培养物进行血清学鉴定，在载玻片上将其与生理盐水混合制成均一性的悬液，观察菌体有无自凝现象，对无自凝性的菌株，按照同样方法与抗原血清混合，同时以生理盐水为对照，观察有无凝集现象。

1.2.4 SN/T 2415—2010方法

（1）DNA提取。取1.2.3中得到的预增菌液1.5 mL于2 mL离心管中，按试剂盒说明书进行DNA提取。

（2）实时荧光PCR检测。实时荧光PCR反应体系（25 µL）为模板2 µL，10×PCR缓冲液2.5 µL，dNTPs 1 µL，引物和探针各1 µL，rTaq 0.5 µL，ddH2O 16 µL。设阴性、阳性和空白对照，其中样品设3个重复，对照设2个重复。实时荧光PCR反应程序为94 ℃、1 min；94 ℃、5 s，60 ℃、20 s，30个循环。

2 结果与分析

2.1 GB 4789.4—2016方法检测结果

2.1.1 菌落形态

BS和XLD平板上的沙门氏菌属典型菌落形态，见标准GB 4789.4—2016的5.3；沙门氏菌显色培养基平板上的典型菌落呈紫红色。本次能力验证样品和对照菌株在3种平板上的菌落形态如表1所示。阳性和阴性对照菌株在3个平板上均呈现出对应的典型菌落特征。2个能力验证样品的菌落形态也基本一致，在BS平板上只有1种典型菌落形态；在沙门氏菌显色培养基和XLD平板上的菌落均有2种形态，且各有1种为典型菌落形态。

2.1.2 生化鉴定

沙门氏菌属的生化反应特征见GB 4789.4—2016中5.4。本文选择BS、XLD和沙门显色培养基平板上的典型菌落进行纯培养后，按照沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒的方法进行鉴定，结果见表2。样品23-J116和23-H756中分离菌株的生化反应均为三糖铁琼脂底层产酸呈黄色、斜面产碱呈紫红色、产气、产硫化氢，赖氨酸脱羧酶阳性，靛基质、氰化钾、尿素均为阴性，均可确定为沙门氏菌阳性。

2.1.3 血清学鉴定

23-J116、23-H756和阳性对照菌株均无自凝性。取样品和对照菌株分别进行多价菌体抗原（O）和鞭毛抗原（H）鉴定，结果显示23-J116、23-H756和阳性对照菌株的抗原（O）和抗原（H）血清均呈凝集现象。

2.2 SN/T 2415—2010方法检测结果

2.2.1 DNA提取

根据标准SN/T 2415—2010中5.5.3对样品DNA浓度和纯度的要求，当DNA浓度为10～100 µg·mL-1，A260/A280比值在1.7～1.9时，适宜于实时荧光PCR扩增。本文用试剂盒对样品和对照菌株的BPW增菌液进行DNA提取，得到的DNA浓度和纯度如表3所示，均满足实时荧光PCR扩增的要求。

2.2.2 实时荧光PCR检测

实时荧光PCR检测体系的有效性要求：空白和阴性对照无荧光对数增长，相应的CT值＞25.0；阳性对照有荧光对数增长，且出现典型的扩增曲线，CT值＜25.0。检测结果的判定要求：样品有荧光对数增长，且CT值≤25，则判定样品阳性。本文的阳性、阴性和空白对照的检测值满足标准有效性的要求，同时样品23-J116和23-H756的CT值均＜25.0，故判定样品为阳性（表3）。

3 结论与讨论

本文采用GB 4789.4—2016的传统培养法和SN/T 2415—2010的实时荧光PCR法检测能力验证样品，得到的检测结果一致，且能力验证获得满意结果。但上述2种方法也各有不足之处，GB 4789.4—2016检测步骤较多，较为耗时；SN/T 2415—2010虽然减少了检测时间，但对检测人员和检测环境的要求较高。刘晓静等[10]开发了一种基于纳米酶的免疫层析试纸条法，该方法的操作简单快速，但目前仅针对肠炎沙门氏菌，且该方法的检出限为103 CFU·mL-1。董永贞等[11]研究出一种纳米酶介导的磁弛豫免疫传感器，在食源性沙门氏菌检测方面具备良好的稳定性，是一种高效、经济且简便的检测方法，但检出限仍然只有50 CFU·mL-1。赵青等[12]研究发现，食源性致病菌存在细菌活的不可培养状态（Viable But Nonculturable，VBNC），该状态下的肠炎沙门氏菌需要在TSB培养基中37 ℃培养7 d方可复苏，因此对于该状态下的沙门氏菌，可能需要有针对性的方法对其进行检验。