体外模拟胃肠消化阶段地热水中砷的价态变化

摘 要：地热水中的砷具有一定的药用价值，不同价态砷离子（ionic As，iAs）所表现出来的药理性和毒理性区别较大。本文旨在通过体外模拟实验，探究胃肠消化阶段富砷地热水中砷的形态变化情况。结果发现，iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值在胃消化阶段的变化与地热水的饮用量无关。肠消化阶段iAsⅢ与iAsⅤ的浓度比与地热水饮用量呈正相关，这为科学有效评估富砷地热水对人类的医疗价值提供了技术参考。

关键词：富砷地热水；体外模拟；离子价态；消化

Changes in the Valence State of Arsenic in Geothermal Water During in Vitro Simulated Gastrointestinal Digestion Stage

ZHOU Huidong， FENG Yuanqiang， SU Siqiang， LI Yonglin， QIU Hao

（Central Laboratory of Geological Mineral Exploration and Development Bureau of Xizang Autonomous Region， Lasa 850033， China）

Abstract： Arsenic in geothermal water has certain medicinal value， and the pharmacological and toxic effects of different valence states of ionic arsenic （iAs） vary greatly. This article aims to explore the morphological changes of arsenic in arsenic rich geothermal water during gastric and intestinal digestion stages through in vitro simulation experiments. The result showed that the concentration ratio of iAs Ⅲ/iAs V was independent of the amount of geothermal water consumed during the gastric digestion stage. In the intestinal digestion phase，the concentration ratio of iAs Ⅲ to iAsⅤ is positively correlated with the amount of geothermal water ingested. This study aims to provide technical references for scientifically and effectively evaluating the medical value of arsenic-rich geothermal water to humans.

Keywords： arsenic-rich hot water; in vitro simulation; ionic valence state; digestion

西藏温泉疗法盛行，《西藏温泉志》记载，达到理疗天然矿泉水开发指标的富砷温泉就有数十处[1-2]，其中日多温泉的地热水作为成熟的医疗地热资源，有较高的药用价值，其总砷含量较高，3价砷离子（ionic As Ⅲ，iAs Ⅲ）与iAsⅤ含量较为均衡，化学组分适中，四季水量稳定[3]。饮用富砷温泉水可以辅助治疗多种疾病，但关于温泉水中砷的生物活性及毒性依然存在较大争议[4-6]。随着元素形态分析技术的日渐成熟，元素有效态检测已经逐步替代总量检测。砷的不同形态对人体产生的药理性或毒理性差异较大，而温泉水中的砷在人体胃肠消化阶段是否会发生形态变化还需进一步研究。

研究某元素在人体内价态变化的方法包括体内实验、活体实验和体外模拟实验。生理提取试验（Physiologically Based Extraction Test，PBET）、体外胃肠道（In Vitro Gastrointestinal，IVG）、简化生物可给性提取试验（Simplified Bioaccessibility Extraction Test，SBET）等体外模拟实验，大都是在结合活体实验数据的基础上，通过不同方法的实验对比建立而成。体外模拟实验具有分析结果相对准确可靠、实验设计简单、周期短、经费需求不高和可控性强等优点，正逐步被认为是研究人体对重金属元素吸收程度的重要方法之一[7-8]。随着体外模拟实验的不断成熟，许多研究人员开始将此方法用于污染物污染土壤的风险评价、重金属元素生物可给性、人体胃肠消化阶段价态变化等方向[9-11]。

PBET方法最早由RUBY等[12]提出，此方法得到的土壤中铅的生物可给性与用活体实验得到的结果在统计学上有较好的相关性。近年来，我国也有诸多学者开始在医药、工业、环境等领域采用体外模拟实验方法进行各种元素的生物可给性与元素价态变化研究，研究成果显著。本文旨在采用生物原理提取法体外模拟胃肠消化过程，通过化学分析方法对比样品在两个消化阶段前后不同形态砷含量的比例来分析胃肠消化环境下砷是否存在形态变化，为我国开发富砷地热水提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用理疗地热水采自西藏自治区日多温泉。冰乙酸、苹果酸、柠檬酸钠、氯化钠、胃蛋白酶、胰酶、胆酸钠、乳酸和碳酸氢钠，均为分析纯；盐酸为优级纯。

1.2 仪器与设备

SHA-C往复式水浴振荡器，常州金坛良友；RION STAR A211 pH计，ThermoFisher；Thermo iCAP TQ电感耦合等离子体质谱仪，ThermoFisher；Thermo 3000液相色谱仪，ThermoFisher；Hamilton PRP-100色谱柱，Hamilton。

1.3 实验方法

本实验选用PBET方法进行体外模拟实验，基于RUBY等[13]、付瑾等[14]的实验理论，参考管培彬等[15]、杨阳等[16]、褚卓栋等[17]、IRIS等[18]的研究方法进行实验设计。根据日多温泉医疗热泉水饮用指南（日饮用量600～1 500 mL）与24 h人体胃液生成机制（日分泌量1.5～2.5 L）设计本实验混合溶液的比例。

1.3.1 体外模拟胃消化阶段

将地热水与模拟胃液（每1 L超纯水中加入0.5 g苹果酸，0.5 mL冰乙酸，0.5 g柠檬酸钠，0.009 g氯化钠，用6 mol·L-1盐酸调节pH值至2.0，再加入1.25 g胃蛋白酶）以不同体积比（1∶1、1∶2、1∶5和1∶9）混合处理来模拟不同饮用量。将混合溶液于37 ℃水浴振荡（150 r·min-1）1 h，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到待测胃提取液，每份样品重复10次并保存于4 ℃以下避光环境，以防止样品组分发生变化。

1.3.2 体外模拟肠消化阶段

用饱和碳酸氢钠溶液调节胃提取液的pH值至6.8，加入10 mL胰酶和胆酸钠的混合溶液（向0.1 mol·L-1的碳酸氢钠溶液中加入终浓度为0.55 g·L-1胰酶和1.875 g·L-1胆酸钠），于37 ℃水浴振荡（150 r·min-1）2 h，期间每隔15 min对溶液进行1次pH值测定，用6 mol·L-1盐酸与饱和碳酸氢钠溶液将pH值稳定至6.8。溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到肠提取液，保存于4 ℃避光环境中，每个样品重复10次。

本实验采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联合技术对处理好的模拟胃消化阶段提取液与模拟肠消化阶段提取液进行测定[19]，流动相为15 mmoL·L-1磷酸二氢铵，流动相pH值为6，设定流速为1 mL·min-1，进样量为100 μL，方法检出限为0.5 μg·L-1，实验结果以三价砷与五价砷的浓度比值表示，以下简称iAsⅢ/iAsⅤ。比值升高，表明溶液中存在五价砷被还原成三价砷的情况；比值降低，表明溶液中存在三价砷被氧化为五价砷的情况。

1.4 统计学方法

实验数据均以x±s表示，采用Python编写代码进行统计学分析，利用t检验法分析每组数据与整体数据之间的差异显著情况，P＜0.05表示在统计学上存在显著差异。对有显著性差异的数据采用最小二乘法进行线性回归与统计学分析。

2 结果与分析

2.1 胃消化阶段不同价态砷含量的测定

本实验采集的地热水样品中iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值为0.106，由表1可知，胃消化阶段的iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值均高于地热水样品，且在不同饮用量之间变化不明显。将iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值带入单样本t检验进行数据分析（n=10），依次将每组数据命名为样本1，一个阶段中所有数据作为总样本，然后分别将样本1的数据与总样本进行对比，分析样本1的数据与总样本是否来自同一分布。假设他们来自同一分布（H0），4组数据均可得P＞0.05，即接受原假设，样本1与总样本之间无显著性差异，说明iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值在胃消化阶段的变化与地热水的饮用量无关。

2.2 肠消化阶段不同价态砷含量的测定

本实验采集的地热水样品中iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值为0.106，由表2可知，肠消化阶段的iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值均高于地热水样品，且iAsⅢ/iAsⅤ浓度比值随地热水饮用量的减少呈明显的下降趋势。

以肠消化后溶液中iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值（y）为纵坐标，以地热水与模拟胃液比例的倒数（x）为横坐标，使用最小二乘法进行线性回归拟合，得y=-0.006 6x+0.241 9，r2=0.898，说明拟合结果良好，见图1。

3 结论

地热水通过胃消化阶段后，iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值增大，但随饮用量变化的程度较小，通过肠消化阶段iAsⅢ/iAsⅤ的浓度比值再次增大，并与地热水饮用量成正比。富砷地热水中的iAsⅤ在体外模拟胃肠消化阶段的实验中会有部分被还原成iAsⅢ，胃肠两次消化阶段都对iAsⅤ向iAsⅢ的还原起到了正向作用。经肠消化阶段后，iAsⅤ进一步被还原为iAsⅢ，不同饮用量情况下iAsⅢ与iAsⅤ的浓度比值随饮用量的增加呈上升趋势。地热水矿化度较高，组分复杂，饮用理疗地热水对人体影响的相关研究较少，本实验以体外模拟胃肠消化阶段相关方法对饮用型理疗地热水中主要药理性元素的价态变化与追踪进行研究与探索，为相关研究人员提供了一定的方法参考。

参考文献

[1]多吉，汞布，李明礼，等.科学泡浴温泉知识手册[M].拉萨：西藏藏文古籍出版社，2019.

[2]佟伟，廖志杰，刘时彬，等.西藏温泉志[M].北京：科学出版社，2000.

[3]李明礼，多吉，王祝，等.西藏日多温泉水化学特征及其物质来源[J].中国岩溶，2015，34（3）：209-216．

[4]欧阳通，刘耀兴，李秋蓉，等.砷污染土壤对人体健康的风险评估应用[J].华侨大学学报（自然科学版）2008，29（1）：152-155.

[5]陈伯扬.微量元素砷与胃癌关系的研究[J].广东微量元素科学，2008，15（3）：15-18.

[6]刘晶，孙铭忆，吴慧敏，等.砷元素形态价态的研究进展[J].中国中药杂志，2023，48（9）：2396-2405.