GC-MS法快速测定淡水鱼中丁香酚类化合物的残留

摘 要：目的：建立一种基于气相色谱-质谱联用技术（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）快速、大批量检测淡水鱼中丁香酚类化合物的方法。对采集的200批次淡水鱼样品（包括黑鱼、鲈鱼、鲫鱼等16个品种）中的丁香酚类化合物残留进行测定与分析。方法：优化样品前处理方法和气相色谱条件。结果：6种丁香酚类化合物在0.02～0.20 mg·L-1线性关系良好，相关系数r2均大于0.999；6种丁香酚类化合物回收率为82.4%～106.0%，相对标准偏差（n=6）为1.6%～9.2%；在200批次淡水鱼样品丁香酚类化合物残留检测中，鲢鱼、鲈鱼、草鱼的检出率较高，均大于50%。结论：该方法操作简单、回收率高，可满足对大批量水产品中丁香酚类化合物的定性检测和定量分析要求，为水产行业可持续发展和食品安全监管提供技术支撑。

关键词：水产品；丁香酚；状况分析；气相色谱-质谱法（GC-MS）

Rapid Determination of Eugenol Residues in Freshwater Fish by GC-MS

WEI Qinfang， HU Wenbin， LYU Xuhong， ZHU Jinyu， XING Feng*

（Zhejiang Fangyuan Testing Group Co.， Ltd.， Hangzhou 310018， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid and large-scale detection method for eugenol compounds in freshwater fish based on gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Determination and analysis of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples collected， including 16 species such as black fish， sea bass， and crucian carp. Method： Optimize sample pretreatment methods and gas chromatography conditions. Result： The six eugenol compounds showed a good linear relationship between 0.02 and 0.20 mg·L-1， with correlation coefficients r2 greater than 0.999; the recovery rates of six eugenol compounds ranged from 82.4% to 106.0%， with relative standard deviations （n=6） of 1.6% to 9.2%; in the detection of residual eugenol compounds in 200 batches of freshwater fish samples， the detection rates of silver carp， sea bass， and grass carp were relatively high， all exceeding 50%. Conclusion： This method is simple to operate， has high recovery rate， can meet the requirements for qualitative detection and quantitative analysis of eugenol compounds in large quantities of aquatic products， it provides technical support for the sustainable development of the aquatic industry and food safety supervision.

Keywords： aquatic products; eugenol; condition analysis; gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

丁香酚因具有成本低廉和麻醉效果好等优势，在渔业中被广泛用作麻醉剂[1]。丁香酚能够有效减轻水生动物在搬运过程中的应激反应，减少其在运输途中的损伤风险，从而显著提高水生动物的生存率。因此在国外被广泛用于水产养殖与运输领域[2-3]。然而，世界卫生组织国际癌症研究机构在2017年将丁香酚分类为第三类致癌物质，这意味着它被认为具有致癌性、致突变性、致敏性等潜在风险[4-5]。国际上，美国、加拿大等北美国家不允许使用丁香酚；新西兰、日本等国家允许限量使用丁香酚，且日本规定了最大残留限量为0.05 mg·kg-1。在我国，关于丁香酚在水产品中使用的研究相对较少，缺少完善的政策法规和标准，也未规定明确的参考限量，这种情况给水产品中丁香酚的使用带来了一定的不确定性和挑战[6-10]。目前，针对丁香酚类化合物的检测分析技术主要包括气相色谱技术[11]、气相色谱-质谱法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[12]、液相色谱-串联质谱法[13]等，其中，GC-MS法具有操作简单、精确度和灵敏度较高等优点[14]。食品补充检验方法《水产品及水中丁香酚类化合物的测定》（BJS 201908）中有对丁香酚类化合物的前处理方法，但该操作复杂费时，且回收率较低。

为了深入了解淡水鱼中丁香酚的残留量情况，加强对市售淡水鱼的食品安全监管[15]。本研究建立了一种气相色谱-质谱法检测淡水鱼中丁香酚类化合物残留量的方法，为水产行业可持续发展以及食品安全的管理工作提出参考性意见[16-17]。

1 材料与方法

1.1 试剂

丁香酚（CAS号：97-53-0）、异丁香酚（CAS号：97-54-1）、甲基丁香酚（CAS号：93-15-2）、甲基异丁香酚（CAS号：93-16-3）、乙酰基异丁香酚（CAS号：93-29-8）和乙酸丁香酚酯（CAS号：93-28-7）标准品（纯度均≥97%），上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司；乙腈（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司；氯化钠、无水Na2SO4，均为分析纯，国药集团；实验用水（超纯水）。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；KQ3200DV超声波提取仪，昆山市超声仪器有限公司；VORTEX GENIUS 3涡旋混匀器，德国IKA公司；JA3003电子天平（0.001 g），上海舜宇恒平仪器有限公司；HP-5MS UI色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美国安捷伦科技有限公司。

1.3 样品采集

基于水产养殖习惯和产品流通特性，本研究对水产品在餐饮服务及流通领域的状况进行了全面调研。调研范围涵盖了11个地级区域的大小型餐馆、批发及零售市场、综合性超市、传统农贸集市、小型食品杂货店以及网络购物平台等众多销售渠道。本次调查共采集了200份淡水鱼类样本，涉及16个不同品种。样品采集完成后，立即送往实验室进行预处理并冷藏保存。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液配制

丁香酚类化合物标准储备溶液：精确量取6种丁香酚类化合物标准样品各10.0 mg，用乙腈溶剂溶解，并定容至100 mL，制备得100.0 mg·L-1标准储备液。分别吸取丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、甲基异丁香酚、乙酰基异丁香酚、乙酸丁香酚酯各1.0 mL标准溶液储备液，用乙腈稀释配制成1.0 mg·L-1标准溶液混合中间液。

混合标准工作液：分别吸取标准溶液混合中间液40 μL、80 μL、200 μL、300 μL、400 μL，用鲫鱼空白基质液稀释配制成0.02 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.15 mg·L-1、0.20 mg·L-1的混合标准工作液。

1.4.2 样品前处理

准确取2 g样品置于50 mL的离心管中，加入20 mL乙腈，4 g氯化钠，5 g无水硫酸镁，用均质器匀浆。以5 000 r·min-1离心3 min，取上清液，加入5 mL用乙腈饱和的正己烷，涡旋混匀。再以5 000 r·min-1离心3 min，弃去上层正己烷溶液。将乙腈层于40 ℃氮吹，用乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，过0.45 μm微孔滤膜，待上机检测。

1.4.3 仪器条件

气相条件：进样口温度：250 ℃；取样量：1 μL；进样方式：不分流进样；温度程序：起始60 ℃维持1 min，以40 ℃·min-1的速率上升至180 ℃，以20 ℃·min-1的速度升至260 ℃。质谱条件：离子源温度：230 ℃；传输线温度：280 ℃；四极杆温度：150 ℃；电子轰击源能量：70 eV；溶剂延迟时间：5 min。6种丁香酚类化合物质谱参数见表1。

1.5 数据处理

采用Word 2007、Excel 2007、Photoshop CC2017软件对本研究数据进行绘图和分析。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

参考《水产品及水中丁香酚类化合物的测定》（BJS 201908）中仪器条件，对气相条件进行优化。如图1所示，通过优化初始温度和升温速率，6种丁香酚类化合物可以达到良好的分离效果且分析时间较短。

2.2 提取溶剂的优化

由于丁香酚类化合物溶于有机溶剂，本研究分别考察了乙腈、丙酮、乙酸乙酯和乙醇4种提取溶剂对丁香酚类化合物回收率的影响。如图2所示，提取溶剂为乙醇时，丁香酚类化合物的回收率最低；当提取溶剂为乙酸乙酯时，6种丁香酚类化合物的回收率在66.4%～70.5%，提取效果较差；而在采用乙腈和丙酮作为提取溶剂时，6种丁香酚化合物的回收率均大于80%。相较于丙酮处理的样本，使用乙腈所得样本中的杂质含量较低。因此，本研究选择乙腈作为提取溶剂。

2.3 提取过程的优化

本实验将样品以15 000 r·min-1匀浆2 min后进行提取，并与BJS 201908标准中的提取方法进行回收率比较实验。由图3可知，相较于优化前，优化样品提取过程后，6种丁香酚类化合物回收率较高，稳定性较好。其主要原因是优化后的提取方法可以保证样品充分浸润和混匀，以缩短提取时间，并提升提取效果。

2.4 方法的线性范围和检出限

采用优化后的仪器条件，将1.4.1配制的混合标准工作液上机测定。以目标物的质量浓度（mg·L-1）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。由表2可知，6种丁香酚化合物在0.02～0.20 mg·L-1线性关系良好，相关系数r2均大于0.999；6种丁香酚化合物的检出限为0.01 mg·kg-1，满足丁香酚类化合物检测要求。

2.5 方法的回收率和精密度

对鲫鱼样品进行加标（加标水平为0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1）回收实验，每个浓度平行测定6次。由表3可知，6种丁香酚化合物的回收率为82.4%～106.0%，相对标准偏差均小于10%，表明此方法准确度和回收率高，重复性好。