不同乙醇浓度手掌参提取物挥发性成分及抗氧化作用分析

摘 要：为探究不同乙醇浓度对手掌参挥发性成分种类及抗氧化能力的影响，本实验采用顶空-气相色谱-质谱法（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）对浓度为75%和95%手掌参乙醇提取物及手掌参原料的挥发性成分进行测定，采用酶标法对两种手掌参乙醇提取物的总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、DPPH自由基和超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力进行评估。结果显示，原料及两种提取物中共检测到82种挥发性物质。其中，95%手掌参乙醇提取物的挥发性成分种类最多，为56种；两种手掌参乙醇提取物共有的挥发性成分为16种，差异成分4种；95%手掌参乙醇提取物的T-AOC及DPPH自由基清除能力显著高于75%手掌参乙醇提取物，但O2-·清除率显著低于75%手掌参乙醇提取物；对甲酚、十六烷酸乙酯、苯乙烯和辛醇等提取物挥发性成分与T-AOC及DPPH自由基清除能力呈显著正相关，与O2-·清除能力呈显著负相关。本研究可为手掌参挥发性功能成分的开发提供参考。

关键词：手掌参；乙醇提取物；挥发性成分；抗氧化能力

Analysis of Volatile Components and Antioxidant Effects of the Different Ethanol Concentrations of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.

CHEN Tianrong， LIU Jiale

（Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Food Science Institute， Lhasa 850000， China）

Abstract： In order to investigate the effects of different ethanol concentrations on the types of volatile components and antioxidant capacity of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.， this experiment used headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） to determine the volatile components of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extracts and Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. raw materials at concentrations of 75% and 95%. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to evaluate the total antioxidant capacity （T-AOC）， DPPH radical and superoxide anion radical （O2-·） scavenging ability of the two Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extracts. The results showed that a total of 82 volatile substances were detected in the raw materials and two extracts. Among them， 95% of the volatile components in the ethanol extract of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. are the most diverse， with 56 types; there are 16 common volatile components and 4 different components in the ethanol extracts of two types of Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.; the T-AOC and DPPH free radical scavenging ability of 95% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract was significantly higher than that of 75% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract， but the O2-· scavenging rate was significantly lower than that of 75% Gymnadenia conopsea （L.） R. Br. ethanol extract; the volatile components of extracts such as cresol， ethyl hexadecanoate， styrene， and octanol were significantly positively correlated with T-AOC and DPPH radical scavenging ability， and significantly negatively correlated with O2-· scavenging ability. This study can provide reference for the development of volatile functional components in the Gymnadenia conopsea （L.） R. Br..

Keywords： Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.; ethanol extract; volatile components; antioxidant capacity

手掌参（Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.）为兰科手参属多年生草本植物，也被称为佛手参、掌参、藏三七等，藏族人称“旺拉”，广泛分布于我国西藏、青海、甘肃和四川等地[1-2]。此外，在朝鲜、日本、俄罗斯等国家也有其分布[3]。手掌参含有丰富的多糖、黄酮、皂苷、生物碱、氨基酸、脂肪、蛋白质和粗纤维等多种成分，目前已从手掌参块茎中分离出170余种化合物[4-6]。现代药理学研究表明手掌参具有抗氧化[7]、抗疲劳[8]、镇静催眠[9]、降低血脂保护肝脏[10]、降低血糖水平[11]、降尿酸作用[12]以及抗缺氧效应[13]等多种功效，且其乙醇提取物具有显著的清除自由基[14]、抗矽肺纤维化[15]、抗肿瘤[16]等作用。但不同乙醇浓度下乙醇提取物呈现不同的生物活性，且目前还没有关于手掌参乙醇提取物挥发性物质的测定研究。本研究基于顶空固相微萃取-气质联用法（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS），对95%和75%两种手掌参乙醇提取物进行挥发性成分的测定和比较分析，并对两种手掌参乙醇提取物进行抗氧化能力评价，以期为手掌参食饮品的开发利用和风味物质研究提供基础参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

手掌参，西藏自治区拉萨市乃仓超市。

无水乙醇，成都金山化学试剂有限公司；总抗氧化能力测定试剂盒（BC 1315）、DPPH自由基清除能力试剂盒（BC 4750）、超氧阴离子能力清除能力试剂盒（BC 1415），均购自索莱宝生物制药有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9203A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；BS223S分析天平，Sartorius；KH-500DE数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；R-100旋转蒸发仪，Buchi；HJ-A6恒温磁力搅拌水浴锅，山东欧莱博仪器有限公司；K6600-B酶标仪；Perkin Elmer Clarus® 690气相色谱仪；Perkin Elmer Clarus® SQ 8T质谱仪；手动固相微萃取进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取头，Supelco®；UPH-II-10T超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司；各量程移液枪，Eppendorf。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

用蒸馏水将手掌参洗净，40 ℃烘干表面水分后，粉碎，过60目筛，40 ℃烘干至恒重，备用。准确称量10.00 g手掌参粉末于500 mL锥形瓶中，按料液比（1∶40）添加体积分数为75%和95%乙醇，于500 W、70 ℃超声辅助提取80 min。将提取溶液过滤后，于60 ℃蒸馏至5～20 mL，恒温水浴干燥至恒重，备用。此时，75%手掌参乙醇提取物提取率约为14.0%，95%手掌参乙醇提取物提取率约为4.0%[12]。

1.3.2 顶空固相微萃取

称取适量75%和95%手掌参乙醇提取物干燥样品于试管中，配制成浓度为20 g·L-1的待测液。取8 mL待测液于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，加入20 μL 50 mg·L-1仲辛醇标准品，将装有待测液的采样瓶置于恒温磁力搅拌水浴锅中于50 ℃平衡5 min，插入装有2 cm萃取头的手动进样器，顶空萃取35 min后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度为250 ℃）中，热解析进样，每个样品重复测定3次。

1.3.3 仪器测定条件

（1）色谱条件。色谱柱为Perkin Elmer Elite-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）弹性石英毛细管柱；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（纯度99.999%）；载气流量1.0 mL·min-1；分流比19∶1；溶剂延迟时间5 min；程序升温：初始温度50 ℃（保留2 min），以3.0 ℃·min-1升温至100 ℃，以6 ℃·min-1升温至150 ℃，以4 ℃·min-1升温至240 ℃，运行时间56.50 min。

（2）质谱条件。离子源为EI源；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；倍增器电压1 538 V；质量范围35～400 amu；数据采集时间范围5～56.5 min。

（3）图谱检索。对各样品及平行样总离子流图，使用Mainlib、Nist-msms、Nist-msms2、Nist-ri、Replib谱图库进行图谱检索和结果分析，用内标法计算各化学成分的相对质量分数。

1.3.4 抗氧化能力测定

将干燥至恒重的75%和95%手掌参乙醇提取物用蒸馏水配制成20 g·L-1的母液，并用蒸馏水稀释至1 g·L-1，按照试剂盒说明书进行总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的测定。

1.4 统计分析

采用GraphPad Prism软件，以单向方差分析方法进行组间均值差异显著性分析，实验数据均以“均值±标准差”表示。P＜0.01表示差异水平极显著，P＜0.05表示差异水平显著。

2 结果与分析

2.1 两种手掌参乙醇提取物挥发性成分分析

2.1.1 两种手掌参乙醇提取物挥发性成分离子流图

样品经1.3处理方法及测定条件下，得到两种手掌参乙醇提取物及手掌参原料挥发性成分总离子流图。由图1可知，通过比较保留时间和峰形，可看出75%手掌参乙醇提取物、95%手掌参乙醇提取物、手掌参原料挥发性物质及其含量存在一定差异，同时也有部分相似的挥发性成分；从丰富度来看，95%手掌参乙醇提取物挥发性成分较为丰富。综上所述，不同乙醇浓度对手掌参提取物挥发性成分提取有显著影响，不同乙醇浓度手掌参提取物及原料挥发性物质存在一定差异。