超声辅助提取大蒜素工艺研究

摘 要：为探究优化超声辅助提取大蒜素的工艺条件，为大蒜的深加工提供依据，以大蒜素含量为检测指标，在传统乙醇溶剂浸提的基础上，采取超声波辅助萃取技术，探究乙醇体积分数、超声时间、超声功率3个因素对大蒜素含量的影响，并在此基础上开展3因素3水平的正交试验，借助极差分析和方差分析，得出最佳的超声辅助萃取工艺。结果表明，3个因素对大蒜素含量的影响均存在极显著差异，3个因素对大蒜素含量的影响大小排序为超声功率＞超声时间＞乙醇体积分数，同时得出了最佳提取工艺参数组合，即超声辅助功率1 000 W、超声萃取时间35 min、乙醇体积分数75%。

关键词：大蒜素；有机溶剂；超声辅助；正交试验

Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Allicin

LI Wenhui， LYU Zhiyuan

（Xinjiang Huachun bio-pharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830000， China）

Abstract： In order to explore the optimization of the technological conditions of ultrasonic-assisted extraction of allicin and provide a basis for the deep processing of garlic， the content of allicin is taken as the detection index， and on the basis of traditional ethanol solvent extraction， ultrasonic assisted extraction technology is adopted to explore the influence of three factors： ethanol volume fraction， ultrasonic time and ultrasonic power on the content of allicin. On this basis， the orthogonal test of three factors and three levels is carried out， and the best ultrasonic-assisted extraction process is obtained by means of range analysis and variance analysis. The results show that the effects of the three factors on the content of allicin are significantly different， the order of influence of three factors on the content of allicin is ultrasonic power＞ultrasonic time＞ethanol volume fraction， and the optimal extraction parameters are obtained， that is， ultrasonic auxiliary power of 1 000 W， ultrasonic extraction time of 35 min and ethanol volume fraction of 75%.

Keywords： allicin; organic solvent; ultrasonic assisted; orthogonal experiment

大蒜（Allium sativum L.）性温、味辛，是餐桌上最常见的食物之一，其可赋予食物辛辣气味，同时其具有调节胰岛素、抗癌、降低血脂和抗炎杀菌等功效，亦可入药，是一种典型的食药两用植物[1]。

大蒜素（Allicin）是天然存在于大蒜鳞茎中的一种有机硫化合物，是蒜氨酸在蒜氨酸酶的催化下生成的硫代亚磺酸酯类化合物，为淡黄色油状液体，学名为二烯丙基硫代亚磺酸酯。大蒜素是大蒜的重要生物活性物质之一，且具有大蒜特有的辛辣刺激气味，是国际公认的具有保健作用和药用价值的生物活性成分[2]。现如今，国内外学者对大蒜素药理作用的研究越来越广泛和深入。大量的科学研究表明，大蒜素易透过红细胞膜及磷脂双分子层，然后进入细胞内，与部分胞内的巯基化合物发生反应，发挥其独特的药理作用[3]。大蒜素对于细菌、真菌和病毒等多种病原性微生物有不同程度的抑制或杀灭作用，是一种广谱抑菌药，具有消炎杀菌、降压降脂、防止动脉硬化、提高机体免疫力等生物学功能[4]。此外，大蒜素可应用于水产养殖和畜牧业，可以有效降低动物发病率，提高其生产性能，降低死亡率，提高生产养殖效益[5]。

目前，国内外有关大蒜素的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法、双水相萃取法和有机溶剂浸提法[6]。然而，这些方法各自都存在一些缺陷，如水蒸气蒸馏法由于高温提取导致蒜氨酸酶失去活性或被破坏，从而影响大蒜素的产率及产物中有效成分的含量；超临界CO2萃取法则存在萃取产物与CO2分离困难等缺陷；传统有机溶剂浸提法存在提取率低、提取时间长等缺点[7]。

为了克服传统提取方法的局限性，有研究者使用超声波作为大蒜提取物的辅助提取工具[8]。因超声波能够有效地破碎植物组织细胞壁结构，加速细胞裂解，促使细胞内容物释放，使破碎更加彻底，同时加快扩散速度，从而大大提高萃取效率[9]。因此，本研究在传统乙醇溶剂浸提的基础上，采取超声波辅助萃取技术提取大蒜素，优化提取工艺，得到最佳辅助提取条件，为大蒜的深加工及大蒜素新产品的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

市售新鲜大蒜；无水乙醇、二硫代硝基苯甲酸、5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸，均为分析纯。试验中所用试剂现用现配。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅，型号BHS-1，福州泰美实验仪器有限公司；电子分析天平，型号BSA323S，赛多利斯仪器（北京）有限公司；组织捣碎机，型号JJ-2，常州市万丰仪器制造有限公司；紫外分光光度计，型号756PC，上海菁华科技有限公司；台式高速离心机，型号3H16RI，湖南赫西仪器装备有限公司；超声清洗仪，型号BILCN10-250，上海比朗仪器制造有限公司。

1.3 大蒜素含量检测方法

1.3.1 乙醇萃取大蒜素的工艺流程

乙醇萃取大蒜素的工艺流程为鲜蒜去皮处理→低温捣碎→制得蒜泥→恒温酶解→有机溶剂（乙醇）萃取→离心分离→取上清液→减压浓缩→蒜素粗提取液。具体操作为将市场购买的新鲜大蒜去皮洗净，用组织捣碎机制成蒜泥，再将捣碎的蒜泥放置在恒温水浴锅，在38 ℃的恒温条件下酶解20 min，之后用65%乙醇溶液作为萃取剂，以1∶4（g∶mL）的料液比，在30 ℃的恒温环境中萃取40～60 min[10]。萃取结束后，取其上层有机相，放入离心机，在温度30 ℃、转速6 000 r·min-1的条件下离心10 min。离心完成取得上清液，设置旋转蒸发仪参数，在0.01 MPa、蒸馏温度50 ℃、转速70 r·min-1的条件下进行减压浓缩，最终制得大蒜素粗提取物[11]。

1.3.2 鲜蒜中大蒜素含量测定

（1）定量检测原理（分光光度法）。将L-半胱氨酸溶液置于大蒜素粗提取液中，大蒜素可与L-半胱氨酸进行反应，反应结束后剩余的L-半胱氨酸再与5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）进行反应，并生成呈色（淡黄色）物质二硫代硝基苯甲酸[12-13]。该物质在412 nm处有最大吸收波长。因此，可使用紫外可见分光光度计测定呈色物质二硫代硝基苯甲酸在反应前后于波长412 nm处吸光值的变化，由此得出L-半胱氨酸的减少量，从而计算大蒜素的含量[14]。

（2）测定方法。用移液枪准确吸取5 mL浓度为10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于试管中，加入1 mL去离子水，充分混匀后吸取1 mL，将其稀释100倍，定容至100 mL容量瓶中备用。准确吸取4.5 mL上述制得的L-半胱氨酸稀释液于试管中，同时加入浓度为1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混匀后将样液放置在恒温水浴锅中，26 ℃下恒温水浴20 min，使体系充分反应（试验所用试剂现用现配）。反应结束后用分光光度计测得其在412 nm处的吸光值（A0），即L-半胱氨酸溶液的初始吸光值[15-16]。

用移液枪准确吸取5 mL浓度为10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于试管中，加入1 mL上述制得的大蒜素粗提取液，充分混匀后吸取1 mL，将其稀释100倍，定容至100 mL容量瓶中备用。准确吸取4.5 mL上述制得的稀释后混合液于试管中，同时加入浓度为1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混匀后将样液放置在恒温水浴锅中，26 ℃下恒温水浴20 min，使体系充分反应（试验所用试剂现用现配）。反应结束后用分光光度计测得其在412 nm处的吸光值（A），即与大蒜素（硫代亚磺酸酯）反应后L-半胱氨酸溶液的吸光值[16]。

大蒜素含量的计算公式[17]为

C=（A0-A）×d×162.26/（2×14 150）（1）

式中：C为大蒜素（硫代亚磺酸酯）的含量，mg·mL-1；A为与大蒜素发生反应后L-半胱氨酸的吸光值；A0为L-半胱氨酸初始吸光值；d为L-半胱氨酸溶液总稀释倍数；162.26为大蒜素相对分子质量；14 150为5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）与L-半胱氨酸反应后生成的二硫代硝基苯甲酸在1 cm光径下的摩尔消光系数。

1.4 超声辅助提取大蒜素工艺研究

1.4.1 单因素试验

采用超声辅助提取大蒜素的工艺研究，重点探究乙醇体积分数、超声辅助功率和超声提取时间这3个主要因素对大蒜素含量的影响[18]。

（1）乙醇体积分数对大蒜素含量的影响。将鲜蒜用组织捣碎机制成蒜泥，准确称量5份样品，每份5 g，然后向这5份样品中以1∶4（g∶mL）的料液比分别加入体积分数为55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液。将各组样液均放置在温度30 ℃下自然酶解30 min，结束后进行超声辅助提取，超声清洗仪参数设置为工作2 s，间歇1 s；超声功率800 W；辅助提取时间35 min。超声辅助提取结束后，离心取上清液，再进行减压浓缩，根据1.3.2（2）大蒜素的含量测定方法，测定吸光值，每个水平重复3次，计算大蒜素的含量[19-20]。

（2）超声时间对大蒜素含量的影响。将鲜蒜用组织捣碎机制成蒜泥，准确称量5份样品，每份5 g，然后在这5份样品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入体积分数为75%的乙醇溶液，将各组样液均放置在温度30 ℃下自然酶解30 min，结束后进行超声辅助提取，设置本组样液的超声辅助提取时间分别为5 min、15 min、25 min、35 min和45 min，其他参数设置为工作2 s，间歇1 s；超声功率800 W。超声辅助提取结束后，离心取上清液，再进行减压浓缩，根据1.3.2（2）大蒜素的含量测定方法，测定吸光值，每个水平重复3次，计算大蒜素的含量。

（3）超声功率对大蒜素含量的影响。将大蒜用捣碎机制成蒜泥，准确称量5份均为5 g的样品，然后在这5份样品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入体积分数为75%的乙醇溶液，将各组样液在30 ℃下酶解30 min，然后进行超声辅助。本组样品超声功率依次设定为200 W、400 W、600 W、800 W和1 000 W，其他参数设置为工作2 s，间歇1 s；辅助提取时间35 min。超声辅助提取结束后，离心取上清液，再进行减压浓缩，根据1.3.2（2）大蒜素的含量测定方法，测定吸光值，每个水平重复3次，计算大蒜素的含量[21]。