刺梨果酒发酵工艺优化及挥发性风味物质分析

摘 要：以刺梨为原料，通过正交实验确定出刺梨果酒酒精发酵的最优工艺条件，并利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（Headspace Solid Phase Micro Extraction Gas Chromatography Mass Spectrometry，HS-SPME-GC/MS）测定刺梨果酒中的挥发性风味物质。结果表明，刺梨果酒的最佳工艺条件为干酵母添加量0.10%、发酵温度28 ℃、发酵时间8 d，由此工艺条件发酵的刺梨果酒在酒精度和感官品质上都表现优异。用气相色谱-质谱联用技术（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）共鉴定出了40种挥发性风味物质，其中酯类20种、醇类10种、醛类7种、其他类3种。本研究为工业化液态发酵刺梨果酒以及刺梨果酒的特征香气物质研究提供一定的理论参考。

关键词：刺梨；发酵；顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术（HS-SPME-GC/MS）；挥发性风味物质

Fermentation Process Optimization and Volatile Flavor Substances Analysis of Rosa roxburghii Wine

ZHANG Lifang， YANG Rui， YE Xin， MOU Rang*

（Inspection and Testing Center of Lichuan， Enshi 445400， China）

Abstract： Using Rosa roxburghii as the raw material， the optimal process conditions for alcohol fermentation of Rosa roxburghii fruit wine were determined through orthogonal experiments， and the volatile flavor compounds in Rosa roxburghii fruit wine were determined using headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME-GC/MS） technology. The results showed that the optimal process conditions for Rosa roxburghii fruit wine were a dry yeast addition of 0.10%， a fermentation temperature of 28 ℃， and a fermentation time of 8 days. The Rosa roxburghii fruit wine fermented under these process conditions exhibited excellent alcohol content and sensory quality. 40 volatile flavor compounds， including 20 esters， 10 types of alcohols， 7 types of aldehydes， and three other categories were identified using gaschromatography-mass spectrometry （GC-MS） technology. This study provides a theoretical reference for the industrial liquid fermentation of Rosa roxburghii fruit wine and the study of characteristic aroma compounds in Rosa roxburghii fruit wine.

Keywords： Rosa roxburghii; fermentation; headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry（HS-SPME-GC/MS）; volatile flavor substances

刺梨（Rosa roxburghii）为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实[1]，这种果实的成熟果皮上生长着小肉刺，并且包裹着种子，故称为“刺梨”。刺梨营养丰富，富含多糖、黄酮、氨基酸等，其中果实内含有丰富的维生素C，被称为“维C之王”[2]。在低酒精度环境中，刺梨中的一些营养物质，如维生素、矿物质等仍能得到保留[3]。同时，刺梨具有多种保健作用，包括调节人体新陈代谢、促进血液循环、控制胆固醇水平、抗衰老及增强抵抗力等[4]。

近年来，随着人们生活水平的不断提高以及健康意识的增强，对于饮酒的选择逐渐从高度酒向低度酒转移，而具有保健作用的果酒更是受到越来越多消费者的青睐。果酒是以人工种植或野生的果品为原料，经过一系列工序进行发酵的一种低酒精度饮料。大部分常见水果，如葡萄、苹果、桑葚、蓝莓等，都能够用于果酒酿造[5]。由于刺梨汁中的单宁、总酸含量较高，使得其在发酵过程中存在发酵周期长，产品酒精度偏低，糖度高以及易氧化褐变并产生氧化味等问题，这在一定程度上阻碍了刺梨果酒的发展[6]。目前利用刺梨进行果酒酿造过程中，研究人员主要关注发酵过程中各类功能性营养物质等的变化情况[7]，以及微生物对发酵底物的利用程度[8]，而缺乏对整个酒体协调性和香气物质的研究。目前研究风味物质最常用的方法是顶空固相微萃取与气质联用技术。该方法操作简单、灵敏度高、萃取效率高以及样品预处理步骤少，且能高效地提取出风味物质并进行鉴定，被广泛应用于葡萄酒、果酒等风味的研究[9]。

本研究对刺梨在液态发酵过程中的发酵工艺进行优化，并采用顶空固相微萃取与气质联用相结合的方法，分析果酒的挥发性风味物质，以期为工业化液态发酵刺梨果酒研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨，无霉变腐烂的野生鲜果，购自贵州省；酵母，安琪葡萄酒果酒专用酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；液体型果胶酶（酶活≥30 000 U·mL-1），宁夏和氏璧生物技术有限公司；蔗糖、偏重亚硫酸钠、乳酸等，均为分析纯，国药集团；2-辛醇，色谱纯，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

TSQ9610三重四极杆气相质谱联用仪，Thermo Fisher Scientific公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supelco公司；MJX-100B-Z恒温培养箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 刺梨果酒酿造工艺流程

选用成熟、完好的刺梨果进行酒精发酵，具体工艺路线如图1所示。

1.3.2 刺梨果酒酿造主要操作要点

（1）去核。去掉刺梨果前端的宿存花萼，将果实对半剖开，刮掉内部种子，只留果肉备用。

（2）打浆。定量称取处理好的刺梨果，置于粉碎机中打碎，然后将粉碎后的刺梨浆置于2 L干净烧杯中，搅拌均匀。

（3）酶解。向装有刺梨浆的烧杯中加入适量无菌水，充分搅拌，然后加入100 mg·L-1偏重亚硫酸钠，并用食品级乳酸调节pH值在4.5～5.0，加入0.05%刺梨质量的果胶酶，在50 ℃下酶解40 min，过滤。

（4）调配。向过滤得到的刺梨汁中加入蔗糖，用乳酸调整pH值在4.0左右，然后分装到三角瓶中。

（5）发酵。称取一定量干酵母，用含2%糖的38 ℃温开水活化20 min，将活化的酵母接种到刺梨汁中，用纱布将发酵瓶封口，放置于恒温培养箱中，于28 ℃下进行酒精发酵。

1.3.3 酒精发酵正交实验设计

根据前期实验，以酒精含量为判定指标，选择酵母添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个因素，进行3因素3水平的正交实验，对刺梨酒精发酵工艺条件进行优化，正交实验因素水平见表1。

1.3.4 理化指标测定

酒精度的测定参照《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》（GB 5009.225—2023）的测定方法进行[10]。

1.3.5 刺梨果酒感官评价

刺梨果酒的感官鉴评方法参考贺红早等[11]的方法，略有改动。选择5名实验室人员对刺梨果酒进行感官评定，主要从外观、色泽、香气、口味和风格5个方面对刺梨果酒进行综合评价并打分，感官评价标准见表2。

1.3.6 刺梨果酒挥发性风味物质测定

按照黄桂东等[12]的提取和测定方法，略有变动。

（1）顶空固相微萃取处理条件。取4 mL过滤后的澄清发酵液，加入到20 mL顶空瓶中，再加入1.0 g NaCl和20 μL内标（2-辛醇，调整浓度为8 800 μg·L-1），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在50 ℃下预热15 min，萃取吸附40 min，250 ℃解吸7 min，用于上机分析。

（2）气相色谱-质谱联用仪处理条件。①气相色谱条件。色谱柱：TG-WAXMS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦气（纯度＞99.999%），不分流；流速：1.0 mL·min-1；进样口温度：250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升温至100 ℃，然后以10 ℃·min-1升温至230 ℃，保持7 min。②质谱条件。离子源：EI源；发射电流：50 μA；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；扫描质量范围：33～400 amu。

（3）定量分析方法。采用内标法进行。该方法基于被检测物质与内标物浓度与吸收峰面积对应的比例关系，计算被检测组分的含量。计算公式为

（1）

式中：Cx代表被检测物质浓度，mg·L-1；Cs代表内标物浓度，mg·L-1；Ax代表被检测物质峰面积；As代表内标物的峰面积。

未知化合物通过与NIST20谱库和化学结构式库进行比对，并通过计算保留指数（Retention Index，RI）确认。

1.3.7 数据处理

采用Excel 2016、SPSS Statistics 21.0等软件对实验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化

酒精发酵过程中，酵母在厌氧环境下可以直接利用糖分产生乙醇。酵母的浓度对发酵液中糖的利用度以及乙醇的产生有影响，主要体现在浓度越高，产生的乙醇越快。然而，当乙醇浓度达到一定水平后，它又会抑制酵母的生长；在一定温度范围内，微生物的生长速率随着温度的升高而加快，但超过最适温度则会抑制微生物的生长；随着发酵时间的进行，糖分的减少、乙醇浓度的增加，导致酒精含量变化速率呈现先升高后变缓趋势。因此，酵母添加量、发酵温度和发酵时间对刺梨果酒酒精发酵过程有着重要的影响作用。本研究根据前期实验结果进行3因素3水平的正交实验。由表3可知，影响刺梨发酵产酒精的因素主次顺序为酵母添加量＞发酵温度＞发酵时间（A＞B＞C）。刺梨果酒的最佳酿造条件为A2B3C1，即在干酵母添加量为0.10%、发酵温度为28 ℃、发酵时间为8 d条件下，刺梨果酒的酒精度最高。将同批次的鲜刺梨果经打浆、过滤、调配等处理后得到预发酵液，然后在发酵液中添加0.10%干酵母，并于28 ℃温度下发酵8 d，发酵结束后测得酒精含量为8.7%vol，与预测值基本一致。