UPLC法测定饮品中鞣花酸和野漆树苷的含量

摘 要：目的：建立超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）同时测定饮品中鞣花酸和野漆树苷含量的方法。方法：采用Waters Acquity BEH C18液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（10∶90，V/V），流速为0.4 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长分别为254 nm

（鞣花酸）和203 nm（野漆树苷）。结果：鞣花酸和野漆树苷在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数分别为0.998 5和0.999 5，平均加标回收率分别在95.01%～104.59%和96.49～104.51%，均符合要求。结论：该方法便捷、可靠、重复性好，适用于测定饮品中鞣花酸和野漆树苷的含量。

关键词：饮品；鞣花酸；野漆树苷；超高效液相色谱法（UPLC）

Establishment of UPLC Method for Determining the Content of Ellagic Acid and Rhoifolin in Drinks

YAN Fangliang， LI Yuzhen

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： Objective： To establish a ultra performance liquid chromatography （UPLC） method for simultaneous determination of ellagic acid and rhoifolin content in drink. Method： Waters Acquity BEH C18 liquid chromatography column （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm） was used， and the mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid aqueous solution （10∶90， V/V）， the flow rate was 0.4 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 254 nm （ellagic acid） and 203 nm， respectively. Result： The linear relationships of ellagic acid and aracin were good in their respective concentration ranges， and the correlation coefficients were 0.998 5 and

0.999 5， respectively. The average recoveries were from 95.01% to 104.59% and from 96.49% to 104.51%， respectively，  which met the requirements. Conclusion： The method is convenient， reliable and reproducible， and is suitable for the determination of ellagic acid and rhoifolin in drinks.

Keywords： drink; ellagic acid; rhoifolin; ultra performance liquid chromatography （UPLC）

鞣花酸，别名并没食子酸和胡颓子酸，是一种含有多酚结构的化合物[1]，存在于葡萄、草莓、石榴等水果以及核桃等坚果中[2]。鞣花酸具有抗氧化的作用，能延缓皮肤的衰老[3-5]，因此被广泛应用于各种具有保健作用的食品和化妆品中[6]。

野漆树苷，又名芹菜素-7-O-β新橙皮糖苷，是一种黄酮苷类化合物，存在于芸香科柑橘属的植物或中药材（枳实、山香圆、化橘红、柚叶）中，一些粮食作物中也有存在[7]。目前，已有研究报道野漆树苷具有抗氧化、抗炎、降血压、壮骨、神经保护、降糖、抗癌和抗病毒等多种生理功能[8-10]。

当前，市售饮品中已有包含鞣花酸和野漆树苷两种成分的产品。鞣花酸或野漆树苷含量的检测方法主要包括近红外光谱法[11]、高效液相色谱法

（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[12-15]和超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）等，而同时检测两种成分的方法还未见报道。基于此，本文建立UPLC法同时检测饮品中鞣花酸和野漆树苷含量的方法，以便更好监控饮品中有效成分的质量水平，也为鞣花酸和野漆树苷的质量研究提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

H-Class液相色谱仪（配备TUV紫外检测器），美国沃特世公司；XS205分析天平（精确至0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料与试剂

供试品（活妍饮品），市售。

鞣花酸标准品，中国食品药品检定研究所；野漆树苷标准品，中国食品药品检定研究所；乙腈、甲酸（色谱级），德国默克公司；PVDF针头式过滤器（0.22 μm），美国密理博公司。

1.3 色谱条件

Waters Acquity BEH C18液相色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1甲酸水溶液（10∶90，V/V）；流速：0.4 mL·min-1；进样体积：2 μL；检测波长：鞣花酸为254 nm，野漆树苷为203 nm；柱温：30 ℃。

1.4 供试品溶液的配制

精密称定供试品1.0 g，用50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）于5 mL容量瓶中定容至刻度线，即得浓度为0.2 g·mL-1的供试品溶液。

1.5 标准系列工作液的配制

分别称取适量的鞣花酸和野漆树苷标准品，加入二甲基亚砜溶解，配成浓度为1.0 mg·mL-1的鞣花酸和野漆树苷标准储备液。

移取一定量的鞣花酸和野漆树苷标准储备液至合适的容量瓶中，用50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）定容，得到鞣花酸和野漆树苷混合工作溶液。鞣花酸标准工作溶液的浓度分别为9.68 mg·L-1、

15.50 mg·L-1、38.70 mg·L-1、96.80 mg·L-1、194.00 mg·L-1及387.00 mg·L-1；野漆树苷浓度分别为5.26 mg·L-1、8.42 mg·L-1、21.00 mg·L-1、52.60 mg·L-1、105.00 mg·L-1及210.00 mg·L-1。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

分别在波长为190～400 nm对制备的鞣花酸和野漆树苷样品进行光谱扫描，根据所得光谱图可知鞣花酸样品最大吸收波长在254 nm左右，野漆树苷样品最大吸收波长在203 nm左右。因此，选择254 nm和203 nm作为两种样品的检测波长。

2.1.2 柱温的选择

设计实验配制6个不同浓度的标准溶液，参照1.3项色谱条件分别在不设置柱温以及柱温为30 ℃、35 ℃、40 ℃的条件下进样检测。结果显示，在不同柱温条件下，目标峰面积的保留时间不同，且随着柱温的增高，组分的保留时间前移；在同一浓度、不同柱温条件下，组分的峰面积相差不大，且浓度与峰面积线性关系良好；当不设置柱温时，组分的保留时间随实验室环境温度变化而改变，可能会对检测的准确性产生影响。综上，选择柱温为30 ℃进行后续实验。

2.2 标准品溶剂的选择

二甲基亚砜能很好地溶解鞣花酸或野漆树苷，也被称为“万能溶媒”[16]。在配制标准工作液时，分别用50%二甲基亚砜水溶液（V/V）、50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）和二甲基亚砜作为稀释溶剂进行进样检测。结果显示，检测鞣花酸时，采用二甲基亚砜作为稀释溶剂线性相关性最好，其次为50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）；检测野漆树苷时，采用50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）作为稀释溶剂时线性相关性最好，其次为二甲基亚砜。综合考虑成本和实验操作的方便性，选择用50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）作为标准品稀释溶剂。

2.3 优化条件下鞣花酸和野漆树苷标准品及供试样品的测定

按照上述优化后的条件，采用高效液相色谱法对鞣花酸和野漆树苷标准品及供试样品分别进行测定，其色谱图如图1所示。由图1可知，标准品和供试样品在30 min内都能实现良好的分离，基线噪声较小且峰型良好，在目标峰附近没有出现溶剂干扰和其他干扰峰，表明优化后的色谱条件可行性良好。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的建立

以峰面积为纵坐标（y），以鞣花酸和野漆树苷的浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到鞣花酸回归方程为y=28 418 953x-296 017（R2=0.998 5），野漆树苷回归方程为y=18 500 100x+43 186（R2=0.999 5），表明鞣花酸和野漆树苷在浓度分别为9.68～387.00 mg·L-1和5.26～210.00 mg·L-1时具有良好的线性关系。

2.4.2 检出限和定量限

称取适量供试品，按照方法要求制备样品溶液，使用50%二甲基亚砜甲醇溶液（V/V）稀释适当倍数，选取信噪比（S/N）=3时，作为该方法的检出限；信噪比（S/N）=10时，作为该方法的定量限。经计算，本方法中鞣花酸的检出限为0.002 mg·g-1，定量限为0.007 mg·g-1；野漆树苷的检出限为0.013 mg·g-1，定量限为0.043 mg·g-1。

2.4.3 精密度实验

移取1.5项中混合标准品工作液，用0.22 μm有机滤膜过滤至液相样品瓶中，按照1.3项色谱条件依次进样6次，记录峰面积，计算鞣花酸和野漆树苷相对峰面积的相对标准偏差，结果如表1所示。由表中结果可知，鞣花酸和野漆树苷相对峰面积的相对标准偏差分别为0.62%和0.65%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

称取适量供试品，按照方法要求制备样品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h及24 h进样，检测并记录峰面积，检测样品溶液的稳定性，结果如表2所示。鞣花酸和野漆树苷峰面积的相对标准偏差分别为1.27%和1.96%，表明该样品溶液在0～24 h较为稳定。

2.4.5 重复性试验

称取适量供试品，按照方法要求制备样品溶液，进行6次平行实验，进样检测饮品中鞣花酸和野漆树苷的含量，计算结果见表3。结果显示，饮品中鞣花酸和野漆树苷含量的相对标准偏差分别为0.89%、0.66%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加标回收实验

称取适量供试品，按照方法要求制备样品溶液，分别在低、中、高3个水平进行加标实验，每个水平重复测定3次，计算回收率，结果见表4。结果表明，鞣花酸和野漆树苷加标回收率符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求。