高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定食品中黄曲霉毒素的不确定度评定

摘 要：本文采用高效液相色谱-柱后衍生法中光化学衍生测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量。结果表明，样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量分别为（0.873±0.039） μg·kg-1、（0.227±0.011） μg·kg-1、（0.811±0.054） μg·kg-1和（0.214±0.014） μg·kg-1，（k=2）。通过系统分析整个测定过程的影响因素，评估不确定度来源，对各个不确定度分量进行评定，可以看出对测量结果影响较大的是测量重复性、标准溶液配制引入的不确定度，而对测量结果影响较小的是样品称量、样品处理后所定容的体积和标准曲线的拟合。

关键词：高效液相色谱法（HPLC）；不确定度；黄曲霉毒素；食品

Uncertainty Evaluation for The Measurement of Aflatoxins in Foods Using High Performance Liquid Chromatography with Post Column Photochemical Derivatization

LI Junwei， LU Dixun， SU Junmei， YANG Jing， CHEN Hanfeng， LIU Chunli*

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： High performance liquid chromatography （HPLC）-post column photochemical derivatization was used to determine the content of aflatoxins B1， B2， G1， G2 in food. The results indicate that when the contents of aflatoxins B1， B2， G1 and G2 in the test samples are （0.873±0.039） μg·kg-1， （0.227±0.011） μg·kg-1，（0.811±0.054） μg·kg-1 and

（0.214±0.014） μg·kg-1， （k=2）， respectively. By systematically analyzing the influencing factors throughout the determination process， assessing the sources of uncertainty， and evaluating each component of uncertainty， it was found that the measurement repeatability and the uncertainty introduced by the preparation of standard solutions have a significant impact on the measurement results， while the impact of sample weighing， the volume after sample treatment and final volume， and the fitting of the standard curve on the measurement results is relatively minor.

Keywords： high performance liquid chromatography （HPLC）; uncertainty; aflatoxins; food

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一类具有相似结构和理化性质的真菌次级代谢产物，它们是自然界中发现的理化性质较稳定的一类霉菌毒素。它们的分子量在312～346，熔点在200～300 ℃。黄曲霉毒素在水中、乙醚、己烷和石油醚中难以溶解，但易溶于甲醇、乙醇、乙腈和氯仿等有机溶剂。黄曲霉毒素对光、热和酸稳定，具有耐热性，因此传统的加热处理对其破坏很小，其只在熔点温度下才会分解。黄曲霉毒素在中性溶液、弱酸性溶液中非常稳定，在pH值为1～3的酸性溶液中略有分解，在pH值为9～10的碱性溶液中会迅速分解，成为接近无毒的盐，但这种分解反应是可逆的，即在酸性条件下可以复原[1]。

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等霉菌代谢产生的一类强效生物毒素，它们会对人类健康构成严重威胁，特别是对肝脏和肾脏的损害尤为显著。黄曲霉毒素常见类型根据毒性大小排列依次为B1、M1、G1、B2和G2，其中B1被国际癌症研究机构分类为I类致癌物。黄曲霉毒素可以在农作物生长、收获、干燥、加工和储存中的任何阶段污染食物，因此大豆、花生、大米、玉米和食用植物油等农产品很容易被黄曲霉毒素污染，从而直接进入食物链。人们食用被黄曲霉毒素污染的食品可导致急性中毒，引起肝脏坏死和出血，长期慢性中毒可诱发肝癌。由于黄曲霉毒素的高毒性和稳定性，它们在全球食品安全和人类健康领域被重点关注[2-3]。

测量不确定度是表征测量结果可信程度的一个参数，它反映了测量结果的可变性或分散性。评定测量结果的不确定度，有助于发现测量过程中的主要误差来源，进而可以采取适当的措施，以提升测量的准确性和可信度。本实验按照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》

（GB 5009.22—2016）[4]第三法高效液相色谱-柱后衍生法中光化学衍生测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2含量，遵循《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[5]的方法程序，对检测过程中的测量不确定度进行评估，旨在提升测量结果的可信度与准确性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国默克公司；氯化钠、氯化钾，均为分析纯，广州化学试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温-20，均为分析纯，德国默克公司；黄曲霉毒素混合标准溶液，美国罗默实验室公司；水符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）中规定的一级水。

Waters Premier 2475高效液相色谱仪配荧光检测器，美国沃特世公司；液相色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国安捷伦公司；XP205 Mettler Toledo分析天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；Pribolab KRC光化学衍生器，青岛普瑞邦生物工程有限公司；IKA LAB DANCER S25涡旋混合器，德国艾卡公司；Milli-Q® IQ 7000超纯水系统，德国默克公司；QSC-12T氮吹仪，上海双旭电子有限公司；Agela Technologies BAC09001-3-X免疫亲和柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

根据《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）第三法高效液相色谱-柱后衍生法中的前处理要求进行。

1.2.2 色谱条件

流动相：A相为水（68%）；B相为甲醇-乙腈（50+50）（32%），等度洗脱；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：50 μL；荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。

1.2.3 数学模型

样品中黄曲霉毒素的计算公式为

（1）

式中：Xi为样品中黄曲霉B1、B2、G1或G2的含量，μg·kg-1；P为样品中黄曲霉B1、B2、G1和G2根据外标法在标准曲线中对应的浓度，ng·mL-1；V1为试样提取液体积，mL；V2为样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，mL；V3为用于免疫亲和柱的分取样品体积，mL；V4为滤液的定容体积，mL；

V5为用于定容的提取液体积，mL；m为样品称样质量，g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线拟合和标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度

2.1.1 标准溶液浓度和峰面积拟合标准曲线引入的标准不确定度

配制不同浓度的系列标准溶液，并分别通过色谱仪进样分析后得到对应峰面积，用最小二乘法对数据进行线性回归分析，拟合得到直线方程和相关系数见表1。

校准曲线为A=bc+a，则标准曲线拟合引入的标准不确定度计算公式为

（2）

（3）

式中：s为标准溶液峰面积的残差的标准差；b为回归直线方程的斜率；a为回归直线方程的截距；n为标准溶液的测定次数；p为用于计算样品溶液浓度c0的测定次数；c0为由拟合校准曲线求得的样品溶液的平均浓度，ng·mL-1；Aj为校准时第j次的标准溶液峰面积；cj为校准时第j次的标准溶液浓度，ng·mL-1；为标准工作液的平均浓度，ng·mL-1。

由AFTB1校准曲线计算得出6次样品平均浓度为c0=1.133 ng·mL-1；由最小二乘法拟合标准曲线得出s=6 722.15；=72.6；b=1 204 497.64；a=-1 686.152，则AFTB1 c0引入的标准不确定度为

AFTB1 c0引入的相对标准不确定度为

根据AFTB2校准曲线计算得出6次样品平均浓度为c0=0.294 4 ng·mL-1；由最小二乘法拟合标准曲线得出s=6 050.48；=4.6；b=2 474 866.22；a=4 550.51，则AFTB2 c0引入的标准不确定度为

AFTB2 c0引入的相对标准不确定度为

根据AFTG1校准曲线计算得出6次样品平均浓度为c0=1.052 ng·mL-1；由最小二乘法拟合标准曲线得出s=3 208.32；=73.3；b=434 189.25；a=

2 287.88，则AFTG1 c0引入的标准不确定度为

AFTG1 c0引入的相对标准不确定度为

根据AFTG2校准曲线计算得出6次样品平均浓度为c0=0.277 4 ng·mL-1；由最小二乘法拟合标准曲线得出s=3 677.58；=4.6；b=1 152 564.81；a=3 135.37，则AFTG2 c0引入的标准不确定度为

AFTG2 c0引入的相对标准不确定度为

2.1.2 标准工作溶液配制引入的标准不确定度

（1）标准物质引入的不确定度评定。黄曲霉毒素标准品浓度及扩展不确定度如表2所示。其中，包含因子k=2，为B类评定，各组分标准工作溶液配制引入的标准不确定度为

AFTB1：

AFTB1：

AFTG1：

AFTG2：

根据各组分浓度，得到标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度为

AFTB1：

AFTB2：

AFTG1：

AFTG2：

表2 黄曲霉毒素标准品浓度及扩展不确定度

组分 浓度/（μg·mL-1） 扩展不确定度/（μg·mL-1）