基于液相色谱-质谱/质谱联用技术的兽药残留检测方法优化研究

摘 要：本文采用液相色谱-质谱/质谱联用技术检测水产品中的磺胺类兽药残留。结果表明，在2～800 ng·mL-1的线性范围下，5种磺胺类兽药的相关系数均大于0.99，说明方程的线性关系良好；5种磺胺类兽药的方法检出限为0.002～0.120 μg·kg-1，定量限为0.012～0.370 μg·kg-1；在25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1的加标水平下，5种磺胺类兽药在水产品中的平均回收率为58.10%～124.37%，相对标准偏差为5.63%～15.03%。

关键词：兽药残留检测；液相色谱；质谱联用技术；流动相参数

Optimization of Veterinary Drug Residue Detection Method Based on Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry

LIN Yang

（Shenzhen Zhongjian Joint Testing Co.， Ltd.， Shenzhen 518000， China）

Abstract： This article uses liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry to detect residues of sulfonamide veterinary drugs in aquatic products. The results showed that within the linear range from 2 ng·mL-1 to 800 ng·mL-1， the correlation coefficients of the five sulfonamide veterinary drugs were all greater than 0.99， indicating a good linear relationship of the equation; the detection limit of five sulfonamide veterinary drugs rang from

0.002 μg·kg-1 to 0.120 μ g·kg-1， and the quantification limit range from 0.012 μg·kg-1 to 0.370 μg·kg-1; at spiked levels of 25 μg·kg-1， 50 μg·kg-1， and 100 μg·kg-1， the average recovery rates of five sulfonamide veterinary drugs in aquatic products was 58.10% to 124.37%， with a relative standard deviation of 5.63% to 15.03%.

Keywords： veterinary drug residue detection; liquid chromatography; mass spectrometry combined technology; mobile phase parameters

随着食品生产规模的扩大，食品安全问题成为当前消费者关注的重点[1]。磺胺类药物属于水产品中常用兽药成分之一，人体若摄入过量，可能导致泌尿系统受到影响，造成泌尿系统结石或堵塞，同时该成分会使人体产生过敏反应，刺激机体生成抗体[2]。为了解磺胺类兽药成分在水产品中的残留问题，早期研究采用免疫分析法检测兽药残留量，但免疫分析法需要确定检测兽药的种类，通过抗原抗体结合识别的方法定量检测残留成分，对于多种兽药成分的检测效率不佳。气相色谱方法对于多种成分的检测效果较好，但该方法对于沸点较高的成分需要以衍生化产物形式检测，衍生化成分可能导致检测存在假阳性问题[3]。为了兼顾兽药残留检测的精度和广度，本文提出了基于液相色谱-质谱-质谱联用技术的兽药残留检测方法，通过优化磺胺类兽药成分的检测参数与试剂条件得到一种检测精度较高的水产品兽药残留检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

鲫鱼、沼虾、黄鳝和河蟹，均购自成都水产农贸市场。甲醇、乙腈和甲酸，色谱纯，德国Merck公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇和乙腈，分析纯，国药集团；磺胺嘧啶（98.0%）、磺胺异恶唑（98.0%）、磺胺二甲基嘧啶（99.0%）、磺胺多辛（97.0%）、磺胺5-甲氧嘧啶（99.0%），德国Sigma公司。4000 Q-Trap质谱仪，Applied Biosystems；HZT-A500电子天平，Mettler toledo；5810R离心机，Eppendorf；Acquity UPLC I-Class液相色谱仪、Waters Oasis HLB固相萃取装置，Waters；N-EVAP 112氮吹仪，Organomation。

1.2 样品前处理

①样品预处理。分别将水产品（鲫鱼、沼虾、黄鳝和河蟹）分为3个样品组，每个样品组至少选取

3个个体进行等质量取样，取样部位为内脏组织、肌肉组织及外表皮组织。所取样品装入灭菌样品管中冷冻保存，待检测前取出。②混合涡旋。准确称取一定量的待测样品，加入对应比例的缓冲溶液进行混合涡旋。③萃取。萃取过程加入萃取剂提取样品，先用涡旋仪振荡1 min，再用超声仪处理8 min。④净化。待测样品在4 ℃条件下离心，10 000 r·min-1，5 min。经过样品预处理、混合涡旋、萃取和净化等操作提取样本内容，待上机检测。

1.3 标准溶液的配制

①储备液的配制。分别称取5种磺胺类标准品各10 mg，用甲醇定容至10 mL，得储备液的浓度为1 mg·mL-1，在-18 ℃下避光保存。②工作液的配制。以空白样品进行样品预处理获取空白基质溶液，用空白基质溶液稀释储备液，配制标准系列工作液的浓度梯度为2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、400 ng·mL-1和800 ng·mL-1。

1.4 提取过程优化

①提取试剂的优化。分别选择甲醇、乙酸乙酯和乙腈为提取试剂，通过加标实验检测提取效果。②填料的优化。为了优化兽药的检测效果，分别以常规填料与多壁碳纳米填料为柱填充，检测样品回收率，确定纳米填料的吸附效果。③淋洗液甲醇浓度及洗脱液甲醇用量的优化。分别研究不同甲醇浓度（5%、10%、15%）和不同甲醇体积（4 mL、6 mL、8 mL和10 mL）对检测回收率的影响。

1.5 仪器条件

（1）色谱条件。BEHC18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μL）；流动相A相为5 mmol·L-1浓度的乙酸铵溶液-0.10%浓度甲醇；B相为甲醇；测试柱温为30 ℃；样品进液流速为0.6 mL·min-1，进液量体积为5 μL；样品检测温度为10 ℃。

（2）质谱条件。母离子（m/z）的扫描范围为50～600，子离子（m/z）的检测范围为50～400[4-5]；质谱检测采用多反应监测扫描模式；毛细管电压为4.0 kV；脱溶剂气流速为800 L·h-1，温度为450 ℃；锥孔气流速和电压为30 L·h-1、40 V。

2 结果与分析

2.1 提取过程优化

①提取试剂的优化。乙酸乙酯的样品平均回收率为45.26%～62.38%，乙腈的样品平均回收率为67.44%～81.45%，而甲醇的样品平均回收率为81.3%～96.8%，相较于乙酸乙酯和乙腈的提取效果更好，因此最终选用甲醇为提取溶剂。②填料的优化。常规填料的样品平均回收率为47.15%，多壁碳纳米填料的样品平均回收率为89.42%，因此采用多壁碳纳米作为实验填料。③淋洗液甲醇浓度及洗脱液甲醇用量的优化。当甲醇浓度为5%时，大部分磺胺类物质的洗脱效率较低，平均回收率仅有30.15%～53.64%；当甲醇浓度为10%时，平均回收率为62.41%～85.15%；当甲醇浓度为15%时，平均回收率为61.33%～82.07%。8 mL甲醇用量的平均回收率为92.15%，4 mL、6 mL、10 mL甲醇用量的平均回收率分别为78.42%、84.04%、86.12%。根据综合洗脱效果选择10%的甲醇水溶液为淋洗液，洗脱过程的甲醇用量为8 mL。

2.2 兽药残留的线性方程、方法检出限与定量限

以标准品的浓度（x）为横轴，以标准品的检测峰面积与内标峰面积比值为纵轴（y），绘制标准曲线。由表1可知，相关系数均大于0.99，说明线性关系良好；磺胺类兽药的方法检出限为0.002～

0.120 μg·kg-1，定量限为0.012～0.370 μg·kg-1。

2.3 磺胺类兽药的回收率与精密度

在空白基质中，分别添加5种磺胺类兽药标准品（浓度分别为25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-13个梯度），重复测定5次。由表2可知，5种磺胺类兽药的平均回收率为58.10%～124.37%，相对标准偏差为5.63%～15.03%，其中磺胺多辛在加标浓度为25 μg·kg-1时的回收率略低，可能是由于磺胺多辛的回收难度较高，而低加标浓度下易受到基质效应影响，导致测定回收率偏低。水产样品中5种兽药成分的检测精密度存在差异，磺胺异恶唑兽药成分在加标浓度为25 μg·kg-1和磺胺二甲基嘧啶兽药成分在加标浓度为50 μg·kg-1时的相对标准偏差数据都偏高，可能是由于低加标浓度下，兽药成分测定值受到基质的影响，导致存在结果偏差，其他兽药成分的检测相对偏差都在10%的范围内，说明研究方法可以用于水产品中磺胺类兽药的检测。

2.4 水产品兽药残留检测

为了评估本方法的实际检测效果，抽样选取水产品进行兽药残留的检测，每组检测的样品数量不低于3个个体，得到5种磺胺类兽药成分的检测数据如图1所示。图1中显示SDZ和SMD两种兽药成分在样品中的检出率较高。其他磺胺类兽药成分的残留量较低，符合检测标准。水产品检测结果中，沼虾和鲫鱼中的磺胺类兽药成分的残留量较低，黄鳝与河蟹中的磺胺类兽药成分检测量明显超出残留量要求。因此监管部门可以根据检测结果监管水产用药，规范养殖用药标准，确保食品安全。

3 结论

本方法对于5种磺胺类兽药在水产品中的平均回收率为58.10%～124.37%，不同加标浓度下的兽药检测相对标准偏差为5.63%～15.03%，说明研究方法能用来检测磺胺类兽药在水产品中的残留量。

参考文献

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[5]万建春，韩颖，马欣欣，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定猪尿中12种禁用兽药残留[J].色谱，2024，42（5）：474-480.