高效液相色谱法测定食品中的纳他霉素

摘 要：目的：建立一种简单快速的样品前处理方法结合高效液相色谱法测定糕点、苹果汁和卤猪肉中的纳他霉素。方法：样品经75%甲醇水溶液、超声波提取，经色谱柱分离，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行等度洗脱，利用高效液相色谱仪进行定性和定量分析。结果：纳他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.995，检出限为0.1 mg·kg-1。对糕点、苹果汁和卤猪肉进行加标回收实验，平均回收率为83.24%～101.60%，相对标准偏差为1.51%～8.21%（n=6）。结论：本方法操作简便快速、灵敏度高，准确性和精密度良好，可满足食品中纳他霉素快速筛查和定量分析的需求。

关键词：纳他霉素；高效液相色谱法；糕点；苹果汁；卤猪肉

Determination of Natamycin in Food by High Performance Liquid Chromatography

WU Jinsong， ZHOU Zesong， CHEN Rubo， CHEN Haolang

（Guangdong Test Center for Green Labelling Co.， Ltd.， Guangzhou 510440， China）

Abstract： Objective： To establish a simple and rapid sample pretreatment method combined with high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of natamycin in pastry， apple juice and brine pork. Method： The samples are extracted by ultrasonication with 75% methanol aqueous solution， separated by chromatography column， and eluted by gradient washing with a mobile phase of methanol - 0.1% formic acid aqueous solution， and analyzed qualitatively and quantitatively by HPLC. Result： The linearity of natamycin in the concentration range of 0.1～10.0 μg·mL-1 is good， the correlation coefficient is greater than 0.995， and the detection limit is 0.1 mg·kg-1. The average recovery of pastry， apple juice and brine pork is from 83.24% to 101.60%， and the relative standard deviation is from 1.51% to 8.21%（n=6）. Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive， accurate and precise， and can meet the needs of rapid screening and quantitative analysis of natamycin in food.

Keywords： natamycin; high performance liquid chromatography; pastry; apple juice; brine pork

随着我国食品产业的蓬勃发展，食品添加剂得到了广泛应用。食品添加剂对于改善食品的色、香、味，调整食品的营养构成，防止食品腐败变质，延长食品的货架期发挥着重要作用。中国商品分类中的食品添加剂种类共有35类，包括增味剂、消泡剂、膨松剂、着色剂及防腐剂等，含添加剂的食品在万种以上[1-2]。纳他霉素，又名匹马霉素、游霉素，是一种由多种链霉素发酵产生的一种近白色或奶油黄色的天然抗真菌化合物，能有效抑制霉菌和酵母菌的生长，且难以被人体消化吸收，对人体造成的伤害较低，因此其应用广泛[3-6]。虽然纳他霉素是国家允许使用的防腐剂，但食用过量也会给人体带来危害[7-8]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定了纳他霉素在糕点、果蔬汁和酱卤肉制品中的最大使用量均为0.3 g·kg-1。

目前，常见的纳他霉素测定方法有高效液相色谱法[9-10]和液相色谱-串联质谱法[11-13]。其中，液相色谱-串联质谱法前处理要求较高，试剂耗材成本较高，不利于大批量食品中纳他霉素的测定。而高效液相色谱法前处理简单，经济效益高，能满足日常检测需求[10，13]。本研究参考《食品安全国家标准 食品中纳他霉素的测定》（GB 5009.286—2022），优化检测方法，提高实验的准确性和稳定性，为检测食品中纳他霉素的含量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糕点、苹果汁和卤猪肉，购自广州市市场；纳他霉素标准品（纯度为98.4%），天津阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；冰乙酸、甲酸（色谱纯），北京迈瑞达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪UltiMate 3000型，并配有VWD检测器，美国Thermo Scientific；EFAA-HM-01型多管涡漩混合仪，上海安谱实验科技股份有限公司；AK-100S型超声波清洗机，深圳钰洁公司；XS205DU型电子天平，广州勤拓公司；HR/T20MM型高速冷冻离心机，湖南赫西公司；Milli-Q型纯水机，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取10.16 mg纳他霉素标准品（精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，加入2.0 mL甲醇和0.1 mL冰乙酸，溶解后定容至刻度，获得浓度为1.0 mg·mL-1的纳他霉素标准储备液。准确吸取1.0 mL纳他霉素标准储备液于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为100.0 μg·mL-1的纳他霉素标准中间液，在0～4 ℃条件下避光保存。检测时，用75%甲醇水溶液配制成浓度为0.1 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的纳他霉素标准曲线工作溶液，现配现用。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长为305 nm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液（体积比75∶25）；流速为1.0 mL·min-1；进样量为5.0 μL；柱温为30 ℃。

1.3.3 样品处理

分别称取糕点和卤猪肉5.00 g置于50 mL离心管中，加入15 mL75%甲醇水溶液，放入涡旋混合仪，涡旋振荡5 min，再超声波提取20 min，加入5 mL纯水混匀，在4 ℃的条件下10 000 r·min-1离心5 min，吸取1.0 mL上清液用0.22 μm的有机滤膜过滤，待测。

称取苹果汁5.00 g置于50 mL离心管中，加入15 mL75%甲醇水溶液，超声提取20 min，在4 ℃的条件下10 000 r·min-1离心5 min，吸取1.0 mL上清液，用0.22 μm的有机滤膜过滤，待测。

2 结果与分析

2.1 HPLC条件优化

2.1.1 流动相优化

本研究对比乙腈和甲醇的有机体系、纯水和0.1%甲酸水溶液的水相体系对纳他霉素色谱峰峰形及响应强度的影响，此时使用Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。结果发现，有机相为乙腈时，纳他霉素峰形较差，不对称；如图1所示，有机相为甲醇时纳他霉素峰形对称。水相为0.1%甲酸水溶液时纳他霉素响应强度较高、峰面积较大。样品色谱图如图2所示，纳他霉素的分离度良好。因此，本研究选用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.1.2 色谱柱选择

对比Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zafex Supfex JX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）两款常用型色谱柱对纳他霉素（10.0 μg·mL-1）的分离效果。结果显示，纳他霉素在Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱上得到较好分离，纳他霉素的峰形对称，且分离度较好；而Zafex Supfex JX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱出现了峰形拖尾的现象。因此，本研究选用Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行检测分析。

2.2 前处理优化

2.2.1 提取溶剂的选择

本研究对比75%甲醇水溶液、甲醇和水作为提取溶剂时纳他霉素的提取效果。按1.3.3方法，选取糕点，添加浓度为10.0 mg·kg-1的纳他霉素标准溶液进行加标回收实验。结果表明，75%甲醇水溶液作为提取溶剂时纳他霉素的回收率最高，为83.72%；相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）最小，为2.50%。因此，本研究选用75%甲醇水溶液作为前处理提取溶剂。

2.2.2 定容液的选择

本研究对比75%甲醇水溶液、甲醇和水作为定容液时纳他霉素的出峰效果。分别用75%甲醇水溶液、甲醇和水配制10.0 μg·mL-1的纳他霉素标准工作溶液，对比三者的色谱图。结果表明，纳他霉素在水和甲醇中响应强度较低，而在75%甲醇水溶液中响应强度较高，峰形较好，没有出现前延或拖尾。因此，本研究选用75%甲醇水溶液配制标准溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围和检出限

配制纳他霉素标准曲线工作溶液进行检测，以纳他霉素的浓度为横坐标（X），以目标峰峰面积为纵坐标（Y），建立线性关系。测得纳他霉素在浓度为0.1～10.0 μg·mL-1时的线性方程为Y=0.398 0X-0.006 4，相关系数为0.999 8，说明纳他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。以3倍信噪比（S/N）确定方法检出限，检出限为0.1 mg·kg-1，说明该方法具有良好的灵敏度，可满足检测需求。

2.3.2 回收率和精密度

选取糕点、苹果汁和卤猪肉进行加标回收实验，分别添加浓度为1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的纳他霉素标准溶液，每个水平进行6次平行实验，以平均回收率来考量方法的准确性，以RSD来考量方法的精密度。如表1所示，纳他霉素的平均回收率为83.24%～101.60%，RSD为1.51%～8.21%，说明该方法的准确性和精密度良好，可以用于实际样品的检测。

2.4 实际样品检测

采用本研究建立的方法对广州市市场购买的糕点10批、苹果汁10批和卤猪肉10批进行检测分析，均未检出纳他霉素。

3 结论

纳他霉素具有高效、不影响食物风味等特点，常被作为防腐剂添加在食品中。为了保障广大消费者的安全，加强检测食品中的纳他霉素十分必要[14]。本研究采用75%甲醇水溶液作为提取溶剂，利用HPLC进行检测，建立食品中纳他霉素的检测方法。通过优化流动相、色谱柱及定容液，纳他霉素峰形对称、响应强度较高。通过优化前处理提取液，纳他霉素的回收率和精密度较高。纳他霉素在0.1～10.0 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，检出限为0.1 mg·kg-1。在3种常见食品（糕点、苹果汁和卤猪肉）中纳他霉素的平均回收率为83.24%～101.60%，RSD为1.51%～8.21%。该方法前处理简单，可操作性强，成本低，可满足大批量食品中纳他霉素筛查和定量分析的需求。