石斑鱼中丁香酚残留量的检测方法及消解规律研究

摘 要：目的：建立气相色谱串联三重四极杆质谱测定石斑鱼中丁香酚残留量的方法，并对丁香酚在石斑鱼内的消解规律进行研究。方法：样品经乙酸乙酯提取，DB-5毛细管柱分离，在多反应监测模式下，外标法定量。结果：丁香酚在10～200 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，线性系数大于0.999 0；检出限和定量限分别为5 µg·kg-1和10 µg·kg-1；添加浓度为10～100 µg·kg-1时，平均加标回收率在99.3%～111.4%，相对标准偏差在1.12%～7.54%。结论：本方法前处理操作简单，灵敏度高，重现性好，适用于石斑鱼中丁香酚残留量的检测。丁香酚在石斑鱼中前3 d消除较快，随着时间的推移，消除速率趋于平缓。

关键词：石斑鱼；检测方法；消除规律

Study on the Detection Method and Elimination Pattern of Residual Eugenol in Grouper

WANG Anwei1， WU Lili2， LIU Tianmi1*， LIN Yi1， LAI Changsheng1

（1.Testing Center of Aquatic Product Quality Safety of Hainan Province， Haikou 570206， China; 2.Hainan Technician College Food Department， Haikou 570206， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of eugenol residues in grouper by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry and to study the digestion law of eugenol in grouper. Method： The samples were extracted with ethyl acetate and separated on a DB-5 capillary column. The samples were quantified by external standard method in multiple reaction monitoring mode. Result： Eugenol had good linear relationship in the concentration range of 10～200 ng·mL-1， with a linear coefficient greater than 0.999 0. The limits of detection and quantification were 5 µg·kg-1 and 10 µg·kg-1， respectively. When the concentration was 10～

100 µg·kg-1， the average spike recovery was 99.3%～111.4%， and the relative standard deviation was 1.12%～

7.54%. Conclusion： This method has simple pretreatment operation， high sensitivity and good reproducibility， and is suitable for the detection of eugenol residues in grouper. Eugenol was eliminated rapidly in grouper within the first

3 days， and the elimination rate tended to be slow over time.

Keywords： grouper; detection method; elimination pattern

丁香酚作为一种麻醉剂，对淡水鱼、海虾等鲜活水产品具有非常好的麻醉效果，常应用于水产品收买、贮存和运送环节[1-5]。但长期食用含丁香酚的水产品可能对人体健康构成潜在的风险，因此美国已将其列入第3类致癌物[6]。

目前，测定水产品中丁香酚残留量的方法有高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7-9]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）[10-11]、气相色谱-串联质谱法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）[12-16]、液相色谱-串联质谱法[17-18]等。本研究旨在开发一种以涡旋振荡提取结合低温高速离心的净化方式，通过样品前处理、色谱和质谱条件的优化，建立一种检测石斑鱼中丁香酚残留量的GC-MS/MS检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用石斑鱼，均购自海口市农贸市场；乙酸乙酯（色谱纯），德国默克公司；有机相针式滤器（尼龙，0.22 µm），上海安谱实验科技股份有限公司；丁香酚标准溶液（1 000 µg·mL-1），天津阿尔塔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D气相色谱质谱联用仪，安捷伦公司；AutoVAP S60全自动高通量透明可视化多样品自动浓缩仪，美国ATR公司；RechBio-GLF三维研磨离心冷冻一体机，上海瑞茋生物科技有限公司；DL-6000B离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

对石斑鱼进行去鳞后，取其肌肉或可食用部分进行均质处理。准确称取2.0 g（精确至0.002 g）均质后的样品，置于50 mL离心管中。加入3 mL乙酸乙酯，涡旋混合10 min，以6 000 r·min-1冷冻离心10 min，取上清液1 mL经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，待测。

1.3.2 标准溶液配制

取1 mg·mL-1的丁香酚标准溶液，用乙酸乙酯稀释成浓度为1 000 ng·mL-1的标准储备液。分别量取浓度为1 000 ng·mL-1的丁香酚标准储备液10 µL、20 µL、40 µL、100 µL、200 µL于1 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度线，得到所需系列标准使用液。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），高纯He（≥99.999%）；流速：1.0 mL·mL-1；进样体积：2 µL；不分流模式进样；进样口温度：260 ℃；柱温箱温度：80 ℃；升温过程：80 ℃停留2 min，以40 ℃·min-1上升到250 ℃，保留5.75 min。

1.4.2 质谱条件

电子轰击离子源；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；辅助加热：280℃；隔垫吹扫流量：3.0 mL·mL-1；分流口吹扫流量：10 mL·mL-1；溶剂延迟：3.75 min；增益因子：1.0；检测模式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。化合物监测参数见表1。

1.5 石斑鱼中丁香酚消解规律研究

对石斑鱼空白样品进行低浓度（20 µg·kg-1）、中浓度（50 µg·kg-1）、高浓度（100 µg·kg-1）加标，每个浓度平行加标6次；分别在5 ℃和-18 ℃状态下放置0 d、1 d、3 d、6 d、10 d、16 d进行测定，取6个平行数据的平均值，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

分别用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷4种有机溶剂进行提取，对其应用效果进行比较。结果显示，用正己烷提取时，回收率较低；用甲醇和乙腈提取时，石斑鱼肉样品易结块，提取液杂质较多不利于后期净化，基线较高，色谱峰有拖尾，回收率起伏较大；用乙酸乙酯提取时，峰形比较理想，无杂质峰干扰，回收率好。因此，选择乙酸乙酯作为提取溶剂。提取液经300 mg/3 mL的固相萃取柱（C18）净化后，峰形与用乙酸乙酯提取相比并没有得到显著改善，且用外标法定量时回收率显著降低。故经综合考虑，用乙酸乙酯提取后直接上机进行检测。

2.2 质谱条件优化

将浓度为100 ng·mL-1的丁香酚标准溶液自动进样，分别在选择离子监测和多反应监测模式下进行质谱扫描。结果显示，在多反应监测模式下丁香酚信号较强，故选择多反应监测模式。分别设定母离子的碰撞能为5 eV、10 eV、15 eV、30 eV、40 eV进行扫描，结果显示离子对的碰撞能在10 eV时信号最优，故离子对的碰撞能设定为10 eV。

2.3 方法检出限、定量限及线性范围

采用仪器自带的数据处理软件对采集的丁香酚质谱数据进行处理，得到标准曲线、色谱图及总离子流图，见图1、图2、图3。在10～200 ng·mL-1浓度范围内，线性方程为y=184.171 295x-55.745 702（r2＝0.999 9），线性符合要求；按照3倍信噪比、10倍信噪比浓度计算得到检出限和定量限分别为5 µg·kg-1和10 µg·kg-1。

2.4 基质效应评价

本研究采用提取后基质匹配添加法评价基质效应（Matrix Effect，ME）。结果显示，ME值为99.8%，表明选用的样品制备条件满足水产品丁香酚残留检测的需要，对检测结果的准确性影响比较小，定量过程不需要基质加标工作曲线进行校正。

2.5 回收率与精密度

根据本研究实验方法，对空白石斑鱼基质进行加标，测定丁香酚添加浓度为10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1的回收率和相对标准偏差，每个水平做6次重复试验，外标法计算，结果见表2。回收率为99.3%～111.4%，相对标准偏差为1.12%～7.54%，说明方法的准确度和精密度良好。

2.6 实际样品测定

本研究从海南省海口市、琼海市、万宁市的农贸市场和石斑鱼收购点抽取石斑鱼100份，采用本方法进行检测。结果显示，有29份石斑鱼样品检出丁香酚成分，检出率为29%，含量在11.2～3 520.7 µg·kg-1。

3 石斑鱼中丁香酚消解规律

如图4所示，在5 ℃环境下，低、中、高浓度在第3天的回收率分别为62.0%、36.1%、43.0%；在20 μg·kg-1时，第6天检测值低于检出限；在50 μg·kg-1时，第10天检测值低于检出限；在100 μg·kg-1时，第16天检测值回收率为30%。在-18 ℃环境状态下，低、中、高浓度在第3天的回收率分别为62.0%、59.6%、56.5%；在20 μg·kg-1时，第10天检测值低于检出限；在50 μg·kg-1时，第16天检测回收率为33.5%；在100 μg·kg-1时，第16天检测值回收率为37.3%。

综上，不同浓度、不同温度状态下石斑鱼中丁香酚回收率随着时间的延长逐渐降低，降低速率也逐渐趋于缓慢；回收率在5 ℃环境状态下降低幅度比在-18 ℃环境状态下大。由此可见，丁香酚消解速率随温度的降低而减慢。同一温度下，在前3 d内丁香酚消解的速度很快，随着时间的推移，消解的速率变缓。