超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中氧氟沙星残留量的不确定度评定

摘 要：依据《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告—1—2008），通过超高效液相色谱-串联质谱法对水产品（鱼）中氧氟沙星的测定过程进行分析，确定整个测定过程中影响结果的不确定度来源，对不确定度进行计算及分析，评定出测量结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。当样品中氧氟沙星含量为66.1 μg·kg-1时，取置信水平p=95%，扩展不确定度为5.0 μg·kg-1（k=2），其结果可表示为（66.1±5.0）μg·kg-1，真实反映测量的置信度和准确性，为采用超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品（鱼）中氧氟沙星药物残留量得出的结果提供可靠的理论依据。

关键词：水产品；超高效液相色谱-串联质谱法；氧氟沙星；不确定度评定

Evaluation of Uncertainty of Ofloxacin Residues in Aquatic Products by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Luhong1，2，3， ZHANG Huiqiong1，2，3， CHEN Ru1，2，3

（1.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Food Industry Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China）

Abstract： According to Agriculture No. 1077—1—2008， the determination process of ofloxacin in aquatic products （fish） was analyzed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， and the source of uncertainty affecting the results during the whole determination process was ensured. The uncertainty was calculated and analysed， and the combined standard uncertainty and extended uncertainty of measurement results were evaluated. When the content of ofloxacin in the sample was 66.1 μg·kg-1， the confidence level p=95%， the expanded uncertainty was 5.0 μg·kg-1（k=2）， the result could be expressed as （66.1±5.0）μg·kg-1， which truly reflected the confidence and accuracy of the measurement. This provide a reliable theoretical basis for the results of determination of ofloxacin residues in aquatic products （fish） by UPLC-MS/MS.

Keywords： aquatic products; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; ofloxacin; uncertainty evaluation

氧氟沙星是一种人工合成抗菌药物，具有抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强和价格低廉等优点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中水产动物的疾病预防与治疗[1-5]。氧氟沙星易残留于动物组织，通过食物链循环进入人体，形成耐药性，长期食用含有该药物残留的食品，可危害人类健康[6-7]。2015年我国农业部第2292号公告[8]规定水产品中不得使用氧氟沙星。近年来，国家市场监督管理总局食品安全监督抽检中关于食用农产品涉及的水产品项目中喹诺酮类兽药残留超标的通告较多[9-12]，其中氧氟沙星项目占据较大比例。因此，检测水产品中氧氟沙星药物的含量非常有必要。

食品检验过程会受到诸多不确定因素的影响，导致实验结果与真值之间存在一定的误差[13-14]。为了保证检测结果的准确性，真实反映被测量估计值的不确定度，需要对不确定度进行测量与分析。测量不确定度一般由若干个分量组成，表征赋予被测量值分散性的非负参数[15-16]。测量不确定度用于判断测量结果的可靠程度，检测过程中影响结果的不确定度来源及影响程度[17]。本文依据《化学分析中不确定度的评估指南》及《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[18-19]，结合《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告—1—2008）对水产品中氧氟沙星残留量的不确定度进行测量与分析，评定测量不确定度[20]。通过对其进行不确定度评定，分析检测过程中的不确定度来源及各分量对实验结果的影响程度，为控制及减少实验过程中所产生的不确定度提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水，一级水；甲醇、乙腈、醋酸铵和甲酸，均为色谱纯；无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用）；氧氟沙星标准品（CAS号：82419-36-1，纯度≥95.71%）；诺氟沙星-D5标准品（CAS号：1015856-57-1，纯度≥99.7%）；液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；分析天平；涡旋混合器；超声波清洗仪；离心机；均质器；旋转蒸发仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理过程

①称取5 g样品于50 mL离心管中，准确加入50 μL诺氟沙星-D5（1 μg·mL-1）内标标准工作液，涡旋混匀，避光放置10 min。②加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，涡旋混合1 min，超声波提取10 min，离心，移取上清液。③残渣中再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，重复提取1次。④合并两次提取液于40 ℃水浴中氮气吹干。⑤加1.0 mL 20%甲醇溶解残留物，再加入2.0 mL正己烷涡旋混合，转入5 mL离心管中，离心，取下层清液过0.22 μm滤膜后供UHPLC-MS/MS分析测定。

1.2.2 标准工作液配制

氧氟沙星标准储备液：准确称取10.53 mg氧氟沙星，用乙腈溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到浓度为1 008 μg·mL-1的氧氟沙星标准储备液。

诺氟沙星-D5内标标准储备液：准确称取4.92 mg诺氟沙星-D5，用甲酸+甲醇（2+98）溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到浓度为491 μg·mL-1的诺氟沙星-D5内标标准储备液。

氧氟沙星标准中间液：吸取0.05 mL氧氟沙星标准储备液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为1.008 μg·mL-1的氧氟沙星标准中间溶液。

诺氟沙星-D5内标标准中间液：吸取0.11 mL诺氟沙星-D5标准储备液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为1.08 μg·mL-1的诺氟沙星-D5标准中间溶液。

氧氟沙星标准工作液：准确移取氧氟沙星标准中间液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和0.50 mL诺氟沙星-D5内标标准中间液于10 mL A级容量瓶中，用20%甲醇溶液定容至刻度，摇匀。氧氟沙星标准工作液浓度分别为5.04 ng·mL-1、10.08 ng·mL-1、20.16 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1和100.80 ng·mL-1，诺氟沙星-D5内标浓度为54.0 ng·mL-1。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱温：40 ℃，流动相：A为0.1%甲酸水、B为甲醇，流速：0.3 mL·min-1，进样量：1 μL。梯度洗脱程序：0～0.50 min，90%A；0.50～5.00 min，90%A～10%A；5.00～6.00 min，10%A；6.00～6.01 min，10%A～90%A；6.01～7.00 min，90%A。

2 结果与分析

2.1 数学模型

样品中氧氟沙星残留量采用标准曲线法及同位素内标法定量，定量结果计算公式为

（1）

式中：X为试样中氧氟沙星的残留量，μg·kg-1；C

为从标准工作曲线上得到的被测组分浓度，ng·mL-1；V为试样最终定容体积，mL；W为样品质量，g。

2.2 不确定度来源分析

超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）测定水产品（鱼）中氧氟沙星残留量的不确定度来源主要有标准工作液配制过程中产生的不确定度、定容体积产生的不确定度、样品称量过程中产生的不确定度、样品进行重复测定产生的不确定度、最小二乘法拟合标准曲线产生的不确定度以及超高效液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度等。

不同的因素及其影响见图1。

2.3 标准不确定度分量评定

2.3.1 配制标准工作液产生的相对标准不确定度urel，1（S）

（1）配制氧氟沙星标准物质引起的相对标准不确定度urel，2（P）。查阅氧氟沙星标准物质证书可知，其扩展不确定度为0.46%（k=2），纯度为95.71%，则其相对标准不确定度平方为u2rel，2（P）=[U÷（k×P）]2=[0.46%÷（2×95.71%）]2=5.775×10-6。

标准曲线所用内标溶液与试样溶液所用内标溶液为同一溶液且加入的量一致，因此配制诺氟沙星-D5内标溶液过程中称样量、稀释体积及纯度的不确定度的分量可忽略不计，只考虑内标溶液取样体积引入的不确定度。

（2）标准物质称量引起的相对标准不确定度urel，3（m1）。氧氟沙星标准物质是由十万分之一电子天平进行称量。根据电子天平检定证书，最大允许误差（MPE）为±0.05 mg，按矩形分布（k=）计算，称取氧氟沙星标准物质0.010 53 g，其相对标准不确定度平方为u2rel，3（m）=[MPE÷（k×m）]2=[0.05÷（×10.53）]2=7.516×10-6。

（3）配制标准工作液配制过程中所用器具引起的相对标准不确定度urel，4（V1）。配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具引起的相对标准不确定度主要来源为容量瓶定容体积、移液枪移取溶液。配制所用的容量瓶经鉴定均为A级，可按国家规范《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定，按三角分布计算，k=；移液器引入的相对标准不确定度，由校准证书得到，按三角分布计算，k=，配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具的最大允许误差及相对标准不确定度的平方如表1所示。